El carboxilato de ciclodextrina mejora la estabilidad y actividad de la nisina en una gama más amplia de condiciones de aplicación. - Grupo de ciclodextrina nativa de Zhejiang

npj Science of Food volumen 7, número de artículo: 20 (2023) Citar este artículo

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La nisina es una bacteriocina natural que exhibe una buena actividad antibacteriana contra las bacterias Gram-positivas. Tiene buena solubilidad, estabilidad y actividad en condiciones ácidas, pero se vuelve menos soluble, estable y activo cuando el pH de la solución excede 6,0, lo que restringió severamente el rango de aplicación industrial de la nisina como agente antibacteriano. En este estudio, investigamos el potencial de formar complejos con nisina con un carboxilato de ciclodextrina, el ácido succínico-β-ciclodextrina (SACD), para superar las desventajas. Se mostraron fuertes enlaces de hidrógeno entre la nisina y SACD, promoviendo la formación de complejos nisina-SACD. Estos complejos exhibieron buena solubilidad en condiciones neutras y alcalinas, y buena estabilidad después de mantenerse a valores de pH altos durante el procesamiento con esterilización con alto vapor. Además, los complejos nisina-SACD mostraron una actividad antibacteriana significativamente mejorada contra bacterias Gram positivas modelo (S. aureus). Este estudio muestra que la complejación puede mejorar la eficacia de la nisina en situaciones neutras y alcalinas, lo que puede ampliar enormemente su rango de aplicación en las industrias alimentaria, médica y otras.

La nisina es un pequeño péptido compuesto por 34 residuos de aminoácidos producido por la cepa de la subespecie Lactococcus lactis, que es la única bacteriocina aprobada como conservante de alimentos1. Generalmente se reconoce como seguro (GRAS) y se usa ampliamente en las industrias alimentaria, medicinal y agrícola. La nisina muestra actividad antibacteriana de amplio espectro contra bacterias Gram-positivas. Se cree que se adsorbe en las membranas celulares de las bacterias, las altera y provoca la liberación de sustancias celulares internas, promoviendo así la muerte celular2,3. En condiciones ácidas (pH < 6,0), la nisina muestra una solubilidad y estabilidad deseables con sólo una ligera pérdida de actividad después del tratamiento térmico4,5. Sin embargo, la estructura de la nisina cambia en condiciones alcalinas debido a una reacción de adición nucleofílica intermolecular, que resulta en una disminución de la solubilidad en agua, la estabilidad térmica y la actividad antibacteriana6,7. Por tanto, la aplicación industrial de la nisina como antimicrobiano natural se limita actualmente a condiciones ácidas.

El pH de la mayoría de los fluidos fisiológicos está en el rango de 6,0 a 8,5, incluidos los fluidos intracelulares, extracelulares e intestinales8. Por lo tanto, para ampliar las aplicaciones industriales de la nisina, se han dedicado esfuerzos a identificar estrategias para mantener su solubilidad, estabilidad y actividad antibacteriana en situaciones fisiológicas. Los ácidos orgánicos pueden asociarse con la nisina en soluciones acuosas mediante enlaces de hidrógeno, lo que puede aumentar el rendimiento de la nisina. Por ejemplo, Adhikari et al. 7 mostraron que un compuesto de nisina y ácido orgánico tenía una actividad antimicrobiana mucho mayor a un pH de 8,0 que la nisina pura. También se ha demostrado que el uso de una combinación de nisina con EDTA aumenta la actividad antibacteriana de la nisina9, lo que se atribuyó a la capacidad del agente quelante para aumentar la permeabilidad de las paredes celulares bacterianas. Sin embargo, no hubo ninguna mejora evidente en la estabilidad de la nisina. Otros esfuerzos destinados a mejorar la estabilidad de la nisina generalmente se basan en sistemas de nanoadministración preparados a partir de biopolímeros, como quitosano, celulosa y pectina3,10,11. Sin embargo, la construcción de estos sistemas de entrega suele ser complicada, costosa y difícil de ampliar, lo que limita su aplicación industrial. En consecuencia, sería ventajoso desarrollar un método simple y económico que pudiera cumplir con los requisitos industriales prácticos.

Las ciclodextrinas (CD) son oligosacáridos cíclicos compuestos por varios números de unidades de α-D-glucopiranosa, que se producen a partir de almidón mediante hidrólisis enzimática y están autorizados para su uso en alimentos y productos sanitarios en la mayoría de las regiones del mundo12. La naturaleza cíclica de las CD conduce a la creación de moléculas que tienen un núcleo hidrofóbico y un exterior hidrofílico, lo que las hace adecuadas como moléculas huésped para incorporar moléculas o restos huéspedes no polares13. La encapsulación de compuestos bioactivos en CD a menudo mejora su dispersabilidad en agua, mejora su resistencia al calor, la luz y el oxígeno y permite una liberación controlada14,15. Anteriormente, los investigadores han demostrado que la encapsulación de nisina dentro de las β-CD mejoraba su actividad antibacteriana durante la conservación de la carne de cerdo cocida16, lo que se atribuyó a la formación de complejos de nisina-CD que cambiaron el microambiente de la nisina. Sin embargo, todavía existe la necesidad de una forma alternativa de CD que pueda mejorar la solubilidad, estabilidad y actividad antimicrobiana de la nisina al mismo tiempo.

La β-CD muestra un bajo costo y una fuerte afinidad de unión a sustancias huésped hidrófobas entre las ciclodextrinas comúnmente utilizadas en la industria alimentaria. Sin embargo, su solubilidad en agua (alrededor del 1,85%) es insuficiente para muchas aplicaciones comerciales17. Por lo tanto, la dosis de β-CD utilizada para mejorar la solubilidad de la nisina estaba restringida en los sistemas prácticos. Derivados de β-CD ampliamente utilizados en aplicaciones farmacéuticas comerciales, incluyendo hidroxipropil-β-CD (HP-β-CD), sulfobutiléter-β-CD (SBE-β-CD) y metil-β-CD (M-β-CD). ) muestran una dispersión del agua muy mejorada después de la modificación química17,18. También se están explorando nuevas estrategias para crear derivados de ciclodextrina de calidad alimentaria. Por ejemplo, se han unido anhídridos octenilo y octadecenil succínico a los grupos hidroxilo de moléculas de ciclodextrina para producir derivados con buenas propiedades emulsionantes19,20. Sin embargo, sustituyentes tan grandes de β-CD pueden afectar su capacidad para incorporar moléculas invitadas debido a efectos de impedimento estérico. En nuestro estudio anterior, se obtuvo un derivado de ciclodextrina, el ácido succínico-β-ciclodextrina (SACD), que demostró ser más de 50 veces más dispersable en agua que la β-CD. Mientras tanto, SACD tiene un comportamiento de complejación significativamente mayor con las moléculas invitadas21. La modificación siguió un procedimiento químico de calentamiento en seco simple y seguro, en el que todos los productos químicos utilizados eran de calidad alimentaria. Se ha demostrado que el SACD obtenido no es citotóxico, lo que podría ser una estrategia prometedora para mejorar la solubilidad y bioactividad de la nisina.

En este estudio, pretendíamos mejorar la solubilidad y la actividad antibacteriana de la nisina formando complejos con SACD. Las interacciones moleculares entre nisina y SACD se dilucidaron analizando las estructuras moleculares y cristalinas de los complejos. Se midieron la solubilidad en agua y la estabilidad del complejo nisina-SACD. Además, se dilucida la actividad antibacteriana de los complejos nisina-SACD contra un patógeno modelo Gram-positivo transmitido por los alimentos (S. aureus.).

Para revelar las interacciones entre nisina y SACD que impulsan la formación de complejos de nisina-SACD, se utilizó el análisis FTIR para comparar las propiedades químicas de nisina-SACD complejada con nisina, SACD y la mezcla física de nisina y SACD (PM nisina+ SACD) (Figura 1a). Las interacciones moleculares entre la nisina y la SACD se ilustraron a partir de los espectros FTIR. El amplio pico de alrededor de 3369 cm-1 se atribuyó a la vibración de estiramiento O-H de las moléculas de SACD. El pico a 1732 cm-1 se atribuyó al estiramiento C=O de los enlaces éster de SACD. Las bandas características en 2929, 1155 y 1027 cm-1 se atribuyeron a los grupos CH2, C-O-C y C-OH de SACD, respectivamente. La banda de absorción máxima ancha de nisina en 3440 cm-1 se atribuyó a vibraciones de estiramiento axial O-H/N-H, la banda en 2923 cm-1 se atribuyó a la vibración de estiramiento de C-H, y la banda alrededor de 1630 cm-1 se atribuyó a la absorción por el grupo amida22. Después de formar complejos con SACD, la banda correspondiente a O–H y N–H se desplazó significativamente a un número de onda más bajo (3269 cm−1), con un cambio de número de onda de −127 y −171 cm−1 en comparación con SACD y nisina, respectivamente. . Mientras tanto, se observó un corrimiento al rojo de 10 cm-1 en la banda del éster C=O para la nisina-SACD a 1722 cm-1. Los fenómenos anteriores indican que se produjeron fuertes enlaces de hidrógeno entre la nisina y la SACD. Presumiblemente, las ramas del ácido succínico en las moléculas de SACD desempeñaron un papel importante en estas interacciones. Otros investigadores también han informado sobre fuertes enlaces de hidrógeno entre componentes similares en complejos23,24. La banda de amida no se observó en el espectro de los complejos nisina-SACD, lo que puede ser el resultado de los efectos protectores del SACD debido a la proporción relativamente baja de nisina en el complejo. El espectro FTIR de la mezcla física de nisina + SACD fue consistente con una combinación de los dos componentes individuales, sin que se observaran cambios de banda obvios. Estos resultados sugieren que la complejación no ocurrió en las mezclas físicas simples de nisina y SACD.

Espectros FTIR (a) y XRD (b) de SACD, nisina, nisina-SACD y mezcla física de nisina y SACD (PM nisina+SACD).

Se sabe que la biodisponibilidad de sustancias bioactivas está directamente correlacionada con la dispersidad de las mismas en matrices. En la industria farmacéutica, la conversión física de sustancias bioactivas del estado cristalizado al estado amorfo se considera un método eficaz para mejorar la dispersidad de las mismas en matrices25. En estudios anteriores, las CD formaban complejos frecuentemente con muchos compuestos bioactivos hidrofóbicos, incluidos nutracéuticos y productos farmacéuticos. Después de la complejación, el estado físico de los compuestos bioactivos pasó de una estructura cristalizada a una forma amorfa con una solubilidad mucho mayor, lo que contribuye a mejorar eficazmente la biodisponibilidad y la bioactividad de los compuestos26,27,28. Por lo tanto, en este estudio se analizó la estructura cristalina de la nisina utilizando un difractómetro de rayos X después de formar complejos con SACD, para predecir la actividad de los complejos nisina-SACD. La nisina exhibió picos de difracción en valores de 2θ de 27,4 ° y 31,7 ° (Fig. 1b), lo que concuerda con estudios previos29. No se observaron picos de difracción distintos para SACD, lo que sugiere que SACD tiene una estructura amorfa21. Sólo se pudo observar un ligero cambio después de formar complejos de nisina con SACD, lo que sugiere que la nisina existía en forma amorfa en los complejos nisina-SACD. Por lo tanto, especulamos que la naturaleza amorfa de los complejos nisina-SACD aumentaría la actividad biológica de la nisina. Como comparación, la mezcla física de nisina + SACD mostró una combinación simple de patrones de difracción de nisina y SACD, incluidos los picos cristalinos agudos de nisina. Estos resultados indican que la nisina permaneció en forma cristalina en las mezclas físicas, lo que demuestra aún más la formación exitosa de complejos nisina-SACD.

La complejación de nisina y SACD provoca cambios en la disposición molecular y las interacciones de la nisina, lo que podría afectar su estabilidad térmica. Por lo tanto, se llevó a cabo un análisis termogravimétrico para evaluar el comportamiento del cambio de masa de los complejos y mezclas de nisina-SACD durante el calentamiento controlado. Generalmente, la pérdida de peso de la primera etapa observada por debajo de 100 °C se atribuyó a la evaporación de la humedad en las muestras. Como se muestra en la Fig. 2a, no hubo una pérdida de peso obvia de nisina en la etapa inicial por debajo de 100 °C, lo que sugiere que quedó atrapada poca agua en la nisina en polvo debido a su escasa hidrofilicidad a pH neutro. Además, solo se observó una ligera pérdida de peso (<7%) para la nisina al final del proceso de calentamiento (600 °C), lo que podría deberse a su alto grado de cristalinidad. Otros investigadores han informado de una estabilidad similar de la nisina en condiciones de calentamiento seco30.

Las curvas TG (a) y dTG (b) de nisina, nisina-SACD, PM nisina + SACD y SACD.

Para SACD, se observaron dos etapas distintas de pérdida de masa durante el calentamiento en las curvas TG. La primera etapa se atribuyó a la evaporación de la humedad debido a la presencia de moléculas de agua atrapadas en la estructura hidrofílica del SACD, lo que contribuyó a aproximadamente el 4,5% de la pérdida total de peso. Al final del calentamiento, se había producido casi el 67 % de la pérdida de peso en esta muestra, lo que se atribuyó principalmente a la degradación térmica de las moléculas de SACD a alrededor de 300 °C y más.

Para los complejos de nisina-SACD, la pérdida de humedad durante la primera etapa de calentamiento fue ligeramente menor que para el SACD puro, lo que podría deberse a que una cierta cantidad de los grupos hidroxilo y carboxilo en el SACD estaban ocupados por la nisina y, por lo tanto, no estaban disponibles para las moléculas de agua. para adsorberse. También hubo una fuerte disminución de la masa alrededor de los 300 °C, que se atribuyó principalmente a la degradación térmica del SACD. A temperaturas más altas, la tasa de degradación térmica fue más rápida para los complejos de nisina-SACD que para el SACD puro, lo que puede deberse a que las fuerzas moleculares eran más débiles.

En comparación con los complejos de nisina-SACD, se mostró una menor pérdida de peso de la mezcla física de nisina y SACD al final del proceso de calentamiento. Podría deberse a que la nisina libre tiene una estructura cristalina altamente estable. Sugiere que la estabilidad al calentamiento en seco de las muestras reflejó y demostró reacciones intermoleculares específicas en complejos nisina-SACD. Sin embargo, los resultados no se correlacionaron directamente con la actividad biológica de la nisina, ya que el cambio en la estructura del péptido podría ocurrir incluso con una pérdida de masa insignificante31.

Para comprender mejor el proceso de calentamiento en seco, las curvas de tasa de cambio de masa de las muestras se calcularon a partir de las curvas TG (Fig. 2b). Las temperaturas en las que tuvo lugar la degradación térmica más rápida se pudieron observar fácilmente en los perfiles dTG resultantes. El pico máximo de descomposición de la nisina se produjo a 333 °C, lo que sugiere que una pequeña cantidad de nisina débilmente cristalizada se degradó a esta temperatura. El pico máximo de descomposición del SACD se produjo a 326 °C, degradándose la mayor parte de esta sustancia a esta temperatura. Para el complejo nisina-SACD, se observó una temperatura de descomposición más baja de 317 °C, lo que es consistente con la presencia de fuerzas moleculares más débiles dentro de sus estructuras amorfas. Curiosamente, se observó un pico amplio alrededor de 504 °C para los complejos nisina-SACD, lo que podría deberse a la degradación térmica progresiva del SACD en los complejos. Las mezclas físicas de nisina y SACD exhibieron una velocidad de descomposición máxima de alrededor de 337 °C, lo que se atribuyó a la degradación térmica del SACD.

La solubilidad y el comportamiento de complejación de la nisina y la SACD se investigaron mediante análisis de espectros UV-vis (Fig. 3). La absorbancia máxima de la nisina pura se produjo alrededor de 201 nm, lo que está relacionado con su estructura secundaria peptídica32. Sin embargo, este pico no pudo observarse en los espectros UV porque la concentración de nisina era demasiado baja. Para el SACD, se observó un pico a 280 nm, que puede estar relacionado con la absorción de ramas insaturadas en las moléculas de SACD33. Después de formar complejos con SACD, la absorbancia de nisina en soluciones acuosas aumentó significativamente al aumentar la concentración de SACD. Sugiere la solubilidad gradualmente mejorada de la nisina. En general, se reconoció que la nisina era soluble en condiciones ácidas. Se observó que la solubilidad de la nisina incluso aumentó significativamente con SACD a pH 2,0 (Fig. 3a), lo que sugiere la aparición de un cambio microambiental de la nisina. La longitud de onda de absorbancia máxima se cambió gradualmente de 201 a 204 nm al aumentar las concentraciones de SACD. Este fenómeno de corrimiento al rojo demuestra una mayor fuerza de interacción hidrofóbica entre la nisina y SACD, lo que contribuye a una mayor no polaridad ambiental de la nisina16. Cuando el pH aumentó a 5,8, la absorbancia de nisina en soluciones mostró valores más altos a la misma concentración de SACD (Fig. 3b). La absorbancia máxima de nisina se desplazó gradualmente al rojo hasta 207 nm a medida que aumentaba la concentración de SACD. Estos resultados sugieren que la complejación de nisina y SACD se hizo más fuerte a medida que aumentaba el pH. Se pudieron observar interacciones más intensas entre los dos componentes a pH 7,4 y 8,0, que se conocían como condiciones menos ventajosas para que la nisina se solubilizara5. En ambas situaciones alcalinas se mostró un fenómeno de corrimiento al rojo aún mayor a 211 nm (Fig. 3c, d). Aunque la absorbancia máxima de la nisina disminuyó ligeramente, la solubilidad de la nisina aún se mantuvo en niveles altos en comparación con la nisina pura en las dos situaciones alcalinas.

Los espectros UV-visible de nisina-SACD con varias concentraciones de SACD (2, 4, 6, 8 y 10 mg/mL) a pH 2,0 (a), pH 5,8 (b), pH 7,4 (c) y pH 8,0 (d); la curva de ajuste de solubilidad de nisina-SACD a pH 2,0 (e), pH 5,8 (f), pH 7,4 (g) y pH 8,0 (h); y los espectros UV-visible de nisina libre y nisina complejada con SACD, HPCD y CD y a pH 2,0 (i), pH 5,8 (j), pH 7,4 (k) y pH 8,0 (l).

Las curvas de solubilidad de nisina en soluciones SACD se trazaron a diferentes valores de pH (Fig. 3e-h). A pH 2,0, la absorbancia de la nisina aumentó linealmente con el aumento de la concentración de SACD. La propiedad hidrofílica relativa de la nisina a un pH de 2,0 podría ser un beneficio para formar complejos con SACD, ya que existía más nisina solubilizada en las soluciones complejantes. Mientras que a pH más alto de 5,8, 7,4 y 8,0, se observaron curvas ajustadas no lineales para la solubilidad de la nisina en soluciones de SACD. Este efecto podría atribuirse a reacciones de adición nucleofílica intermolecular que ocurrieron con la nisina, que redujeron la solubilidad de la nisina a un pH alcalino de 34. Afortunadamente, SACD mostró efectos satisfactorios que obstaculizaron la transformación no deseada de la nisina en condiciones relativamente alcalinas, lo que permitió que la nisina fuera soluble en el rango de pH aplicado.

Para distinguir la efectividad de SACD para ampliar el rango de aplicación de nisina, comparamos además el comportamiento de complejación de nisina con SACD y dos CD de uso común, β-CD y HP-β-CD (Fig. 3i-l). Tanto la β-CD como la HP-β-CD muestran mejoras considerables en la solubilidad de la nisina. Se observaron corrimientos al rojo obvios para la longitud de onda en la absorbancia máxima en condiciones relativamente alcalinas (por ejemplo, la absorbancia máxima de nisina en solución de HP-β-CD apareció a 205 nm a pH 8,0). La absorbancia de nisina en soluciones que contienen HP-β-CD fue mayor que la que contenía β-CD para las cuatro situaciones de pH determinadas. Sin embargo, los valores máximos de absorbancia de nisina en soluciones SACD estaban mucho más allá del valor de nisina en soluciones de β-CD o HP-β-CD. Por lo tanto, se podría concluir que SACD mostró algunas ventajas al promover la solubilidad de la nisina en situaciones neutras y alcalinas. Estos resultados indican que la combinación de nisina con SACD puede aumentar en gran medida su dispersabilidad en agua, lo que sería beneficioso para una utilización más amplia de la nisina en diversas industrias.

La estabilidad de los complejos nisina-SACD a diferentes valores de pH se evaluó midiendo la nisina solubilizada en soluciones después de 0 y 10 días de almacenamiento. El índice de retención (RI) se calculó a partir de estos datos y se utilizó para indicar la estabilidad de la nisina en los diferentes complejos (Fig. 4). Todas las muestras mostraron buena estabilidad después de almacenarlas durante 10 días, con valores de RI superiores al 100%. Este resultado sugiere que la complejación fue capaz de estabilizar la nisina en todos los valores de pH estudiados y que la formación de complejos puede haber sido relativamente lenta. En particular, los valores de RI de la nisina en los complejos que contenían concentraciones bajas de SACD fueron apreciablemente más altos que los que contenían concentraciones altas. Según un estudio anterior, hay múltiples ramas de éster en una molécula de SACD, que pueden unirse a la nisina, como lo muestra el análisis FTIR21. Como péptido con una estructura molecular relativamente desordenada, es difícil que la nisina forme complejos completamente con moléculas SACD relativamente pequeñas. Se necesita tiempo para que la nisina se extienda y encuentre esos sitios desocupados en las superficies de las moléculas de SACD. Cuando se incluyó más SACD en los sistemas, se observó menos aumento del RI de nisina. Puede deberse a que había menos sitios libres en la molécula de nisina disponibles para unirse al SACD.

El índice de retención (RI) de los complejos nisina-SACD a diferentes concentraciones de SACD (2, 4, 6, 8 y 10 mg/ml) después de mantenerlos a pH 2,0, 5,8, 7,4 y 8,0 durante 10 días. La barra de error representa la desviación estándar de tres pruebas de la misma muestra.

Se determinó la resistencia de los complejos de nisina-SACD a la esterilización con vapor a alta temperatura porque la estabilidad térmica de las formulaciones es importante para las aplicaciones industriales. Estudios anteriores han demostrado que la degradación química de la nisina se produce cuando se procesa térmicamente34, lo que reduce su actividad antibacteriana3,35. Después de formar complejos con SACD, no se observó degradación térmica de la nisina en ningún pH estudiado y hubo un aumento apreciable en la cantidad de nisina solubilizada después del tratamiento térmico (Fig. 5). Estos efectos fueron más pronunciados para los complejos que contenían concentraciones bajas de SACD (2 mg/ml), que mostraban más del doble de nisina solubilizada en comparación con aquellos sin esterilización. El efecto de solubilización se hizo más notable a valores de pH más altos, solubilizándose hasta tres veces más nisina en la solución de SACD de 2 mg/ml después del tratamiento térmico. Cuando había más moléculas de SACD presentes durante el proceso de complejación, la mejora de la alta temperatura en la solubilización de la nisina parecía reducida, lo que podría deberse a que la saturación de los complejos entre la nisina y la SACD solo se produjo gradualmente. Aun así, todavía se observó un aumento apreciable en el valor RI de nisina (>120%) a una concentración de SACD de 10 mg/ml. En un estudio anterior, la complejación de la nisina con goma arábiga y pectina la protegió de la degradación térmica a 121 °C, pero la solubilidad de la nisina no mejoró1,3. Estos resultados sugieren que la complejación con SACD no solo aumentó la estabilidad térmica de la nisina, sino que también aumentó su solubilización durante el calentamiento.

El RI de los complejos nisina-SACD con diferentes concentraciones de SACD (2, 4, 6, 8 y 10 mg/ml) y situaciones de pH (2,0, 5,8, 7,4 y 8,0) después del tratamiento a 121 °C durante 30 min. La barra de error representa la desviación estándar de tres pruebas de la misma muestra.

Finalmente, determinamos la actividad antibacteriana de los complejos nisina-SACD desarrollados en este estudio contra S. aureus. S. aureus se utiliza comúnmente como modelo de bacterias Gram positivas para predecir los efectos antibacterianos del agente bacteriostático. Mientras tanto, es una causa importante de enfermedades transmitidas por los alimentos que provocan gastroenteritis, diarrea y vómitos36. Alimentos susceptibles a la intoxicación por S. aureus, incluidos la carne, los huevos y los productos lácteos37. Se sabe que la nisina puede desactivar las bacterias adsorbiéndose en la membrana celular, alterando la membrana celular y promoviendo la pérdida de componentes intracelulares esenciales38. Como se muestra en la Fig. 6a, la nisina pura exhibió solo una actividad antibacteriana moderada en las condiciones utilizadas, y el valor de DO600 de la suspensión bacteriana disminuyó de 1,23 a 0,46 (2,7 veces). Para observar el cambio en la membrana celular de las bacterias después del tratamiento con complejos de nisina-SACD, se observó la microestructura de la superficie de las bacterias tratadas mediante la recopilación de imágenes SEM (Fig. 6b). La apariencia de las bacterias pasó de una forma esférica a una forma irregular, lo que demuestra la rotura de la membrana celular. Por el contrario, los complejos nisina-SACD mostraron una actividad antibacteriana mucho más fuerte, con un valor de DO600 que disminuyó a 0,04 (31 veces). Casi no se pudieron observar estructuras similares a células en la imagen SEM para la colección de cultivos tratados con complejos de nisina-SACD. Este aumento de la actividad antimicrobiana se puede atribuir al aumento de la solubilidad y estabilidad química de la nisina en los complejos. Además, el aumento del efecto bactericida de los complejos también podría deberse a cierta actividad antibacteriana del SACD. SACD contiene grupos carboxilo en su superficie que podrían crear un microambiente más ácido alrededor de las bacterias, dificultando así su crecimiento27,39. En nuestro estudio anterior, SACD puro en una dosis relativamente alta mostró actividad antibacteriana contra S. aureus27. Nuestros resultados, por tanto, sugieren que la presencia de SACD mejoró los efectos antibacterianos de la nisina al formar complejos que aumentaron su solubilidad y actividad.

Los valores de DO600 de los cultivos bacterianos sin ningún tratamiento y tratados con SACD, nisina y complejos nisina-SACD (a). Las imágenes SEM de S. aureus recolectadas de cultivos de muestras en blanco, SACD, nisina y complejos nisina-SACD (b). La intensidad de fluorescencia de bacterias vivas/muertas en cultivos de S. aureus tratados con muestras en blanco, SACD, nisina y complejos nisina-SACD (c). La barra de error representa la desviación estándar de tres pruebas de la misma muestra.

Para respaldar la aplicación práctica de los complejos nisina-SACD, se determinó la concentración inhibidora mínima (MIC) de nisina-SACD y HSS-nisina-SACD. Los dos complejos tenían una CMI de 20 mg/ml y 40 mg/ml frente a S. aureus, respectivamente. Sin embargo, no se observaron efectos antibacterianos significativos en el rango de concentración establecido para el uso de nisina y SACD solos. Aunque se observó una CIM más alta para HSS-nisina-SACD, la complejación con SACD aún muestra una protección y preservación significativas de la actividad biológica de la nisina después del tratamiento a alta temperatura. Después de tratar las bacterias con nisina-SACD o HSS-nisina-SACD en sus niveles de MIC, tanto las bacterias totales como las muertas existían en niveles bajos en comparación con el grupo no tratado (Fig. 6c). Indica que la proliferación de bacterias fue efectivamente prohibida. Se observó cierto grado de inhibición de la proliferación bacteriana simplemente tratando el cultivo bacteriano con nisina o SACD como se demostró anteriormente. Los resultados confirmaron nuevamente que la formación de complejos entre nisina y SACD exhibió un efecto sinérgico y mejoró significativamente la actividad biológica de nisina y SACD. Li et al. informaron que existía un efecto sinérgico similar entre la nisina y el carvacrol. 40.

En este estudio, se utilizó SACD para mejorar la solubilidad, estabilidad y actividad antibacteriana de la nisina mediante la formación de complejos moleculares. Se infirieron fuertes interacciones entre las moléculas de nisina y SACD debido a los desplazamientos al rojo apreciables de picos específicos observados en los espectros FTIR. La estructura molecular altamente cristalizada de la nisina se transformó en una estructura amorfa después de formar los complejos nisina-SACD. Las interacciones moleculares más débiles en los complejos que en la nisina pura redujeron su estabilidad térmica general. Sin embargo, la nisina dentro de los complejos parecía permanecer estable ante la degradación a temperaturas más altas. La espectroscopía UV-visible sugirió que las interacciones entre la nisina y el SACD dependían del pH de la solución circundante, ocurriendo interacciones más fuertes a valores de pH más altos. Estos resultados sugieren que la complejación de nisina con SACD podría mejorar su solubilidad, estabilidad y actividad en situaciones neutras y alcalinas. Además, la complejación mejoró la resistencia de la nisina a la esterilización con alto vapor. Finalmente, se demostró que la actividad antibacteriana de los complejos nisina-SACD y HSS-nisina-SACD es mucho más efectiva que la nisina pura contra una bacteria Gram-positiva modelo (S. aureus). En general, nuestros resultados indican que la complejación de nisina con SACD tiene un gran potencial para mejorar su utilización como agente antibacteriano en formulaciones alimentarias o farmacéuticas. En el futuro, serán necesarios estudios in vitro e in vivo para evaluar la seguridad y eficacia de estos complejos. Además, será necesario superar todos los obstáculos legales y de ampliación antes de que puedan utilizarse ampliamente en aplicaciones prácticas.

La nisina de Streptococcus lactis, la β-ciclodextrina (≥99,5%, β-CD), el ácido succínico (SA) y el hipofosfito de sodio (SHP) se adquirieron de Aladdin Regent Co. (Shanghai, China). Otros productos químicos eran de calidad analítica. Se utilizó agua desionizada para preparar soluciones acuosas en todos los experimentos.

SACD se preparó utilizando el método descrito en nuestro estudio anterior21. Brevemente, se mezclaron y agitaron 4,00 g de β-CD, 2,96 g de SA, 4,00 g de SHP y 40 ml de agua desionizada hasta su total solubilización. Después de verter la solución mezclada en un plato circular (diámetro 160 mm), la muestra se secó en un horno a 100 °C durante 3 a 5 h. Luego, la placa se transfirió a otro horno a 140 °C y se mantuvo durante 20 minutos para permitir que ocurriera la reacción de esterificación. Después de enfriar las muestras esterificadas a temperatura ambiente (alrededor de 0,5 h), el producto bruto se recogió solubilizándolo primero en 20 ml de agua desionizada y luego se precipitó añadiendo un exceso de volumen de etanol absoluto. Este proceso de lavado se repitió otras dos o tres veces para garantizar que no quedaran impurezas en el producto final. Después de lo cual, la muestra se secó durante la noche para eliminar el etanol y se recogió el producto final.

La nisina se complejó con SACD solubilizando 1 mg de nisina en 10 ml de solución de SACD (400 mg/ml). Después de mezclar bien, la solución se centrifugó a 10.000 rpm durante 5 minutos para eliminar las sustancias insolubles. El sobrenadante se recogió y se liofilizó para convertirlo en polvo para la evaluación del estado sólido.

Se evaluó el impacto del pH sobre la solubilidad de la nisina en soluciones SACD. Se prepararon soluciones con concentraciones de SACD de 0, 2, 4, 6, 8 y 10 mg/ml solubilizando SACD en solución tampón con diferentes valores de pH. Las muestras resultantes se denominan nisina libre, nisina-SACD2, nisina-SACD4, nisina-SACD6, nisina-SACD8 y nisina-SACD10, respectivamente. Excepto cuando se usó HCl para ajustar el pH a 2,0, se usaron soluciones tampón fosfato para preparar diferentes valores de pH (5,8, 7,4 y 8,0). Luego, se añadió 1 mg de nisina a las soluciones de SACD anteriores con diferentes valores de pH. La concentración de SACD osciló entre 2 y 10 mg/ml en cada valor de pH. Las suspensiones resultantes se agitaron durante 8 h a 25 °C para que la nisina alcanzara una solubilización saturada. Después de eliminar las sustancias no disueltas pasando a través de filtros de tamaño de poro de 0,45 μm, la cantidad solubilizada de nisina se cuantificó utilizando un espectrofotómetro UV-visible (UV-1800PC, Mapada, China) a 201 nm. Las interacciones huésped-huésped entre la nisina y SACD se pudieron observar a partir de los cambios de longitud de onda de la absorbancia máxima de la nisina después de formar complejos con SACD. Luego se construyeron las curvas de solubilidad de la nisina en soluciones de SACD a diferentes valores de pH trazando el valor de absorbancia en función de la concentración de SACD. Se prepararon grupos de control adicionales que utilizaron nisina formando un complejo con 10 mg/ml de β-CD y 10 mg/ml de HP-β-CD a pH 7,4 para demostrar la eficacia de la nisina-SACD. Las muestras se denominan nisina-CD10 y nisina-HPCD10, respectivamente. Todos los demás procedimientos utilizados para preparar las soluciones complejas fueron los mismos que para las muestras de nisina-SACD.

Los espectros infrarrojos de las muestras en polvo se recolectaron utilizando un espectrómetro FTIR (Nicolet Nexus 470, Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, EE. UU.) con números de onda de 400 a 4000 cm-1.

La estructura cristalina de los complejos de nisina-SACD potenciados se determinó mediante análisis de difracción de rayos X (XRD) utilizando un instrumento comercial (D2 PHASER, Bruker, Alemania) a un voltaje operativo de 40 kV y un ángulo de difracción (2θ) que oscila entre 4 ° a 40°.

El comportamiento térmico de los complejos nisina-SACD se evaluó utilizando un sistema de análisis termogravimétrico (TG) (TGA2, Mettler-Toledo, Schwerzenbach, Suiza) en atmósfera de N2 (50 ml/min) a una velocidad de calentamiento de 10 °C/min a una temperatura rango de 30 a 600 °C.

Para evaluar los efectos del pH sobre la estabilidad de nisina-SACD, se determinó la cantidad de nisina en las soluciones complejas 10 días después de la solubilización. La duración del almacenamiento se estableció en base a experimentos preliminares que garantizaron que el proceso de complejación alcanzara el equilibrio total. La estabilidad térmica de los complejos nisina-SACD también se evaluó exponiéndolos a un tratamiento de esterilización con vapor de alta presión a 121 °C durante 30 minutos. La fracción de nisina solubilizada dentro de los complejos nisina-SACD se determinó midiendo la absorbancia a 201 nm utilizando un espectrofotómetro UV-visible (UV-1800PC, Mapada, China). Como grupo de control, se llevaron a cabo los mismos procedimientos sobre una suspensión de nisina. Luego se calculó el índice de retención (RI) utilizando la siguiente ecuación:

Las actividades antimicrobianas de las muestras se determinaron utilizando S. aureus (ATCC 6538) como bacteria Gram positiva representativa. La densidad óptica (DO) se utilizó para evaluar la actividad antibacteriana de la nisina y los complejos nisina-SACD41,42. Las bacterias se precultivaron en medio Luria-Bertani a 37 °C durante 24 h para obtener cultivos de semillas. Estos cultivos de semillas se diluyeron luego a 106 UFC usando medio Luria-Bertani. Se pesaron 1 mg de nisina, 50 mg de nisina-SACD (que contiene 1 mg de nisina) y 50 mg de SACD y se agregaron a 10 ml de cultivo de bacterias diluidas por separado. Se utilizó un cultivo de bacterias que no contenía muestra como grupo de control en blanco. Después de incubar a 37 ° C durante 24 h, el crecimiento de bacterias en los medios de cultivo se determinó registrando la DO a 600 nm (OD600) utilizando un espectrofotómetro UV-visible (UV-1800PC, Mapada, China).

Después de confirmar la actividad antibacteriana de los complejos de nisina-SACD, la CIM de los complejos de nisina-SACD se midió adicionalmente mediante el método de microdilución en caldo según lo informado por Li et al. 40. La concentración inicial de nisina, SACD, nisina-SACD y nisina-SACD esterilizada con vapor a alta presión (HSS-nisina-SACD) se estableció en 400 µg/ml, 40 mg/ml, 40 mg/ml (que contienen 400 µg/ml de nisina) y 40 mg/ml (que contienen 400 µg/ml de nisina), respectivamente. Luego, las soluciones iniciales se diluyeron en serie hasta que su concentración alcanzó 3,125 µg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,3125 mg/ml y 0,3125 mg/ml, respectivamente. Luego se cultivaron 100 µl de las muestras a diferentes concentraciones con diluciones de 100 µl de S. aureus que contenían 106 UFC de bacterias en placas de 96 pocillos. Las placas se incubaron a 37 °C durante 24 h. La concentración a la que la DO600 no era significativamente diferente de la del grupo en blanco (sin inoculación bacteriana) se consideró como CMI. S. aureus tratado con nisina-SACD y HSS-nisina-SACD en MIC se tiñó adicionalmente usando un kit de tinción doble de bacterias vivas/muertas (LMAI Bio, China), y el número de bacterias totales y de bacterias muertas se pudo representar mediante la fluorescencia. valor de intensidad directamente. Tenga en cuenta que no existe una relación estadística entre la intensidad de fluorescencia de las bacterias totales y las bacterias muertas, ya que están teñidas por dos tintes fluorescentes diferentes.

Después de cultivar con nisina-SACD, SACD y nisina, se visualizó la morfología de las bacterias utilizando un microscopio electrónico de barrido (SU8100, SEM, Hitachi, Japón). Las muestras se depositaron sobre cinta de negro de carbón y luego se recubrieron con oro antes del análisis.

Todas las mediciones se realizaron en muestras separadas por triplicado. Los resultados que dieron valores numéricos se presentan como medias ± desviaciones estándar. El análisis ANOVA de los datos experimentales se realizó utilizando el software estadístico SPSS 20 (SPSS Inc., Chicago, EE. UU.). Las diferencias se consideraron a un nivel de significancia del 95% (p < 0,05).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (BK20210458).

Laboratorio Estatal Clave de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Escuela de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Centro de Innovación Colaborativa de Seguridad y Control de Calidad de los Alimentos en la Provincia de Jiangsu, Universidad de Jiangnan, Wuxi, Jiangsu, 214122, China

Yao Hu, Kequan Xing, Long Chen, Jie Long, Aiquan Jiao, Xueming Xu, Zhengyu Jin y Chao Qiu

Facultad de Industria Ligera e Ingeniería de Alimentos, Universidad Forestal de Nanjing, Nanjing, Jiangsu, 210037, China

Xiaojing Li

Facultad de Ciencias Alimentarias y Farmacéuticas, Universidad de Ningbo, 169 Qixing South Road, Ningbo, Zhejiang, 315832, China

Shangyuan Sang

Departamento de Ciencias de los Alimentos, Universidad de Massachusetts, Amherst, MA, 01060, EE. UU.

David Julián McClements

Centro de Innovación Avanzada de Beijing para la Nutrición Alimentaria y la Salud Humana, Laboratorio Conjunto China-Canadá de Nutrición Alimentaria y Salud (Beijing), Escuela de Alimentación y Salud, Universidad Tecnológica y Comercial de Beijing (BTBU), 11 Fucheng Road, Beijing, 100048, China

Jin Peng Wang

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Correspondencia a Jinpeng Wang, Zhengyu Jin o Chao Qiu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Hu, Y., Xing, K., Li, X. et al. El carboxilato de ciclodextrina mejora la estabilidad y actividad de la nisina en una gama más amplia de condiciones de aplicación. npj Sci Food 7, 20 (2023). https://doi.org/10.1038/s41538-023-00181-7

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Recibido: 01 de agosto de 2022

Aceptado: 13 de febrero de 2023

Publicado: 20 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41538-023-00181-7

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