Evaluación de ciclodextrinas polianiónicas como andamios de unión de alta afinidad para fentanilo

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 2680 (2023) Citar este artículo

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Se ha demostrado previamente que las ciclodextrinas (CD) muestran afinidades de unión de equilibrio modestas (Ka ~ 100–200 M-1) por el analgésico opioide sintético fentanilo. En este trabajo, describimos la síntesis de nuevas CD que poseen restos tioalquilcarboxilo o tioalquilhidroxilo extendidos y evaluamos su afinidad de unión hacia el clorhidrato de fentanilo. La CD óptima estudiada muestra una notable afinidad por el opioide de Ka = 66.500 M-1, el valor más alto reportado para tal complejo de inclusión hasta la fecha. Los experimentos unidimensionales de resonancia magnética nuclear (RMN) 1H y de espectroscopía Overhauser de marco rotacional (2D-ROESY) respaldados por simulaciones de dinámica molecular (MD) sugieren un comportamiento de unión inesperado, con el fentanilo capaz de unirse al interior del CD en una de dos orientaciones distintas. . Las energías de enlace derivadas del trabajo de simulaciones de MD se correlacionan fuertemente con las afinidades derivadas de NMR, lo que destaca su utilidad como herramienta predictiva para la optimización de candidatos de CD. El desempeño de estas moléculas huésped presagia su utilidad como plataformas para contramedidas médicas para la exposición a opioides, como biosensores y en otras aplicaciones de la ciencia forense.

Los opioides sintéticos a base de fentanilo han encontrado numerosas aplicaciones en el campo médico como anestésicos eficaces y se consideran más seguros que la morfina durante los procedimientos perioperatorios1,2,3. Su potente actividad se debe a su capacidad para unirse a varios receptores nociceptivos del sistema nervioso, siendo uno de sus principales objetivos el receptor opioide μ4,5. Al igual que la morfina y otros alcaloides diseñados para combatir el dolor, los fentanilos lamentablemente presentan un alto riesgo de dependencia y adicción debido a su efecto eufórico sobre el sistema nervioso central (SNC). Desafortunadamente, su uso ilícito ha provocado una alta tasa de muerte relacionada con sobredosis en lo que se reconoce en gran medida como una epidemia de fentanilo6,7,8,9.

El compuesto emblemático de esta clase de opioides es el fentanilo, que tiene una potencia ~100 veces mayor que la de la morfina (Fig. 1a)10,11. Aunque tanto el fentanilo como la morfina presentan un potencial tóxico si no se administran cuidadosamente a un individuo, el fentanilo suele ser motivo de mayor preocupación debido a su producción mucho más sencilla. Además, dada la facilidad de síntesis del opioide, la producción de nuevos análogos caracterizados por perfiles analgésicos aumentados no es difícil12,13,14. Además de sus usos médicos, algunos de estos opioides, como el acetilfentanilo, se han relacionado con casos de sobredosis mortales por uso recreativo, mientras que el carfentanilo y el remifentanilo se han relacionado con su uso como agentes de guerra química (Fig. 1b)15,16. A medida que los opioides a base de fentanilo han aumentado tanto en potencia como en uso en las últimas décadas17, importantes investigaciones se han centrado en el desarrollo de métodos analíticos eficientes para su detección9,16,18 y en antídotos eficaces para contrarrestar sus efectos fisiológicos19,20. Antídotos como la naloxona y la naltrexona (Fig. 1c) se han convertido en los principales métodos de tratamiento de sobredosis; sin embargo, todavía carecen de la capacidad de brindar una protección prolongada contra estos opioides sintéticos. Esta eficacia reducida se debe a la larga vida media en circulación del opioide en la sangre (t1/2 ~ 7-9 h), mientras que las vidas medias en circulación de la naloxona y la naltrexona son significativamente más cortas en t1/2 ~ 2 h y t1/2. ~ 4 h, respectivamente19. Para abordar este problema, grupos de investigación han lanzado programas destinados a desarrollar candidatos a contramedidas médicas (MCM) que brinden protección a más largo plazo contra los fentanilos, particularmente cuando el individuo afectado es retirado de la intervención médica de emergencia. Algunos de estos esfuerzos han girado en torno a la noción de emplear moléculas huésped que podrían, en principio, capturar opioides sintéticos en su interior y, dependiendo de su afinidad de unión hacia ellos, podrían ser andamios eficaces para ser utilizados como MCM. Una clase de sistemas huéspedes que ha sido estudiada en detalle por el grupo Isaacs de la Universidad de Maryland para este propósito y también para la reversión de la anestesia han sido las cucurbit[n]urils21,22. Su trabajo, que comenzó con estos huéspedes de base cíclica, condujo al eventual descubrimiento de un huésped poderoso para la metanfetamina23 y el fentanilo24 que era curiosamente de naturaleza acíclica, por lo que le proporcionaba suficiente flexibilidad para modificar su captura efectiva del opioide. Otro conjunto de huéspedes similares pero basados ​​en un esqueleto de carbohidratos son las ciclodextrinas, que desafortunadamente han sido evaluadas marginalmente para estas aplicaciones25.

(a) Estructuras químicas del fentanilo y la morfina; la potencia del opioide en relación con la morfina (~ 100x) se proporciona junto con su vida media en la circulación sistémica (t1/2); (b) estructuras de dos de los antídotos más comunes utilizados para tratar la intoxicación por fentanilo, la naloxona y la naltrexona, junto con sus vidas medias en la circulación sistémica; (c) estructuras de análogos de fentanilo encontrados en varios casos de sobredosis en los EE. UU. (acetilfentanilo), así como otros utilizados como agentes incapacitantes (carfentanilo y remifentanilo), se proporcionan sus potencias en relación con la morfina; (d) estructura de β-ciclodextrina que muestra las siete unidades de glucosa unidas en forma α1,4 dando lugar a una estructura cónica (frustrum) abierta en ambos extremos con un interior hidrófobo y un exterior hidrófilo; (e) representación de un hipotético complejo de inclusión formado entre β-CD y fentanilo.

Las ciclodextrinas (CD), motivos de oligosacáridos cíclicos compuestos de unidades de glucosilo unidas entre sí mediante enlaces α1,4-glicosídicos (Fig. 1d), han atraído recientemente la atención como posibles candidatos a contramedidas médicas. La disposición cíclica de estas unidades de glucosa da lugar a una estructura macromolecular que se asemeja a un tronco con un borde inferior más grande que el superior (Fig. 1e). Esta disposición proporciona a los CD un exterior hidrófilo y un interior hidrófobo capaz de acomodar moléculas orgánicas, una propiedad física clave de estos compuestos26,27. Esta capacidad de servir como huésped molecular ha convertido a los CD en plataformas versátiles para su uso en la industria28, la medicina29 y la ciencia de materiales30. Naturalmente, cuanto mayor sea el número de unidades de glucosa, mayor será la cavidad del tronco y, por tanto, su capacidad para albergar huéspedes más grandes en su interior. Un mango experimental crucial y útil que tienen los investigadores es el huésped: los complejos huéspedes, también llamados complejos de inclusión, pueden estudiarse mediante varios métodos espectroscópicos que incluyen espectroscopías UV-Vis31, infrarroja32 y resonancia magnética nuclear33, así como métodos espectrométricos como la cromatografía líquida. espectrometría de masas (LC-MS)34. Nuestro trabajo anterior se ha basado principalmente en la RMN para estudiar complejos entre las CD nativas y el fentanilo y otras toxinas (Fig. 1e)25,35. Haciendo uso de extensos estudios de titulación de RMN junto con la espectroscopia de Overhauser de marco rotacional bidimensional (2D-ROESY), se pueden determinar las afinidades de unión de CD:fentanilo, así como la estructura del complejo. Aunque previamente se demostró que se forman complejos de inclusión entre las CD nativas y el fentanilo, las afinidades de unión eran bajas y no significativamente fuertes como para justificar su uso como un posible aglutinante de fentanilo. En este informe, presentamos la síntesis de estructuras de CD más complejas que se observa que forman fuertes complejos de inclusión con fentanilo. Nuestros esfuerzos han aprovechado las valoraciones de RMN para determinar la fuerza de unión entre el candidato principal actual, llamado "subetadex" (SBX), y el fentanilo. Además, se logró información importante sobre la estructura del complejo SBX:fentanilo mediante experimentos de RMN 2D-ROESY. Se descubrió que estos datos experimentales concordaban con los cálculos de modelado computacional que también se utilizaron para explorar candidatos adicionales a estructuras de CD con afinidades mejoradas por el fentanilo.

Este trabajo se centra en la exploración de estructuras de CD más complejas alentadas por nuestros estudios iniciales sobre la captura de fentanilo con CD nativas y simplemente sustituidas25, así como el conocimiento de otras estructuras de CD que han encontrado con éxito importantes aplicaciones biomédicas por su capacidad para unirse y eficazmente. neutralizar objetivos específicos. Uno de esos CD es Sugammadex (SGX), que es un fármaco aprobado por la FDA para el tratamiento de pacientes que experimentan efectos anestésicos postoperatorios prolongados del bromuro de rocuronio (RocBr)36,37,38,39,40. SGX fue descubierto en 2001 en Organon Laboratories36 y mostró una fuerte afinidad por RocBr al tiempo que minimizaba los efectos secundarios potencialmente tóxicos. Después de años de evaluación, SGX fue aprobado por la FDA en 2015 y ahora se ha convertido en un tratamiento común para aliviar los síntomas anestésicos asociados con el uso de RocBr en el entorno quirúrgico debido a su naturaleza no tóxica y la fuerte asociación compleja constante para el anestésico (Ka ~ 750.000 M-1) determinado mediante experimentos de titulación por resonancia magnética nuclear (RMN)41. Al igual que SGX, el presente trabajo buscó identificar un candidato a EC con un perfil no tóxico y al mismo tiempo que mostrara una alta afinidad por el fentanilo y los opioides sintéticos relacionados.

Estructuralmente, SGX se basa en un núcleo γ-CD cuyo borde superior está modificado químicamente con cadenas de ácido 3-mercaptopropanoico. Estos restos adicionales sirven para alargar el interior hidrófobo de la CD nativa. Según nuestros estudios anteriores25, se descubrió que la cavidad γ-CD era demasiado grande para acomodar el fentanilo en su interior, y los cálculos MD mostraron que el opioide pasó la mayor parte del tiempo de simulación sin consolidar. Por esta razón, los esfuerzos de detección iniciales se centraron en estructuras basadas en β-ciclodextrina-(β-CD), ya que su interior se adaptaba mejor al opioide. Nuestros datos de RMN anteriores y simulaciones de MD mostraron que los fentanilos se unen a la β-CD nativa en el anillo de fentanil amida fenilo, aunque las afinidades de unión observadas fueron bastante bajas (Ka <250 M-1). Se descubrió que las estructuras de estos complejos determinadas a partir de estos datos dejaban la mayor parte de la molécula de fentanilo fuera de la CD, con su grupo fenetilo en gran parte solvatado por agua. Estas interacciones entálpicamente desfavorables explican en parte los complejos débiles observados. Para mejorar la complejación, se imaginaron CD que encierran una fracción mucho mayor del opioide, proporcionando así interacciones más favorables, principalmente van der Waals y Coulombic34. La biblioteca analizada en este trabajo actual se basa en el huésped β-CD con ligeras variaciones en una modificación común, a saber, la sustitución de todos los grupos hidroxilo de 6 posiciones con tioalquilcarboxilatos o tioalquilalcoholes de cadena lineal (Fig. 2).

Esquema estructural básico de una βCD con su borde superior, el resto hidroxilo C6 reemplazado por un grupo R generalizado. Hay dos tipos de restos investigados en este trabajo, los aniónicos que comprenden CD que presentan los grupos 2-mercaptoacetilo (SBX-1, 1), 3-mercaptopropionoílo (SBX, 2) y 4-mercaptobutanoílo (SBX + 1, 3). El segundo tipo de restos implica aquellos que llevan restos neutros en el borde superior que incluyen 2-mercaptoetanol (SBN-1, 4), 3-mercaptopropanol (SBN, 5) y 4-mercaptobutanol (SBN + 1, 6). Además de estos objetivos basados ​​en βCD, también se sintetizaron y evaluaron por separado SAX (Sualphadex, 7) y SGX (Sugammadex, 8); sin embargo, ambos no mostraron ninguna unión significativa al fentanilo.

Las afinidades de unión de equilibrio entre el panel de CD y fentanilo·HCl se determinaron mediante experimentos de valoración por RMN 1H. Para derivar la constante de unión más precisa, los experimentos se diseñaron de manera que la concentración de CD [H]T (en unidades de M) satisficiera la desigualdad [H]TK <1 siempre que fuera posible. Los estudios iniciales requirieron estimaciones aproximadas de K ya que a priori eran desconocidas. Se monitorearon los cambios químicos de 1H NMR de los protones indicadores en CD (H3 y H5) mientras se agregaba gradualmente la solución valorante de fentanilo. Los datos representativos de estas valoraciones se encuentran en la Fig. 2 de la Información de respaldo. El ajuste de mínimos cuadrados no lineal se realizó utilizando expresiones matemáticas apropiadas para los datos de unión obtenidos. Este ajuste se realizó en todas las curvas de titulación de protones indicadores simultáneamente, generando una afinidad de unión global para cada par CD:fentanilo25. Los resultados de este procedimiento de ajuste se dan en la primera columna de datos de la Tabla 1.

En la mayoría de los casos, los datos de RMN podrían ajustarse a un modelo que describa la unión como un sistema simple 1:1. Sin embargo, los datos del gráfico de trabajo de RMN, que se utilizan para justificar el uso de dicho modelo, mostraron una clara desviación de un modelo de unión 1:1 tanto para SBX como para SBX + 1, con máximos ligeramente alejados de la fracción esperada, r = 0,5 (ver Fig. 1 en Información de respaldo). Estos datos instaron a considerar un modelo 1:1 de dos estados que fuera capaz de describir tanto el comportamiento observado en el gráfico de trabajo como el de las valoraciones mismas. Además, los datos de titulación mostraron un comportamiento claramente no monótono para múltiples protones informadores (consulte la Fig. 2 en la Información de respaldo).

La Figura 3 compara las afinidades de unión determinadas por RMN para complejos CD:fentanilo 1:1 con las energías de unión de simulación MD (valores indicados en las columnas de la derecha de la Tabla 1). Los datos para α-CD y β-CD de nuestro trabajo anterior se incluyen para que estén completos. Para los aniónicos SBX-1, SBX y SBX + 1 (2–4), los resultados de RMN muestran una fuerte correlación con el comportamiento predicho por las simulaciones de MD. Es decir, la afinidad de unión aumenta con la energía de unión probablemente debido a las interacciones mejoradas de van der Waals proporcionadas por la naturaleza hidrofóbica de la cadena principal alargada de los tioalquilcarboxilatos aniónicos. Esta afirmación está respaldada por trabajos computacionales adicionales que muestran una meseta en la afinidad por los CD que muestran brazos aniónicos más extendidos (p. ej., SBX + 2 y SBX + 3 (no sintetizados)). Esta observación indica que hay pocas ventajas para los brazos de tiocarboxilato de más de cuatro carbonos (es decir, SBX + 1), que son suficientes para encerrar completamente la molécula de fentanilo (es decir, complementariedad de tamaño óptima). Sin embargo, nos abstenemos de sobreinterpretar cualquier comparación directa de RMN/MD, ya que las cantidades derivadas de MD ignoran el efecto de la entropía conformacional en la termodinámica general. En otras palabras, la energía libre no se calcula estrictamente. En lugar de ello, se calcula una energía promedio, denominada < U + W > como se describió anteriormente41.

Afinidades de unión de RMN (modelo simple 1:1) versus energías entálpicas determinadas a partir de la simulación para el confórmero dominante de fentanilo unido a los huéspedes 1 a 6 y a la α- y β-ciclodextrina31. Tenga en cuenta que la afinidad informada aquí para SBX + 1 es la conformación dominante de los andamios de CD neutros del modelo 1:1 de dos estados más complejo (67 mM-1) dados como círculos; todos los demás como cuadrados rellenos. La línea sólida es un ajuste lineal a puntos de datos llenos considerando incertidumbres de medición. La línea discontinua tiene pendiente RT (0,602 kcal mol-1 a ​​303 K).

Para los CD neutros (es decir, SBN-1, SBN y SBN + 1), las simulaciones iniciales de MD predijeron una afinidad de unión mejorada al aumentar la longitud del brazo de manera similar a sus contrapartes aniónicas. Sin embargo, los datos de RMN muestran una disminución dramática en la afinidad de unión, que en realidad empeora con el aumento de la longitud del brazo (ver Tabla 1, Fig. 1). Los datos estructurales de RMN de los experimentos ROESY muestran correlaciones claras entre los protones H3 y H5 interiores del CD y los de sus brazos de tioalquilhidroxilo (consulte la Información de respaldo). Simulaciones MD adicionales de estos CD neutros solos en solución respaldaron este comportamiento. En última instancia, la fuerza impulsora hidrófoba que existe para que los brazos de tioalquilhidroxilo hidrófobos se orienten dentro de la cavidad de CD parece impedir que el fentanilo se una a través de un efecto competitivo y de autounión con brazos más largos que se unen mejor dentro de la cavidad. Luego inferimos que los brazos de tiocarboxilato de las CD cargadas no solo proporcionan la solubilidad acuosa necesaria de la CD sino que, posiblemente más importante, probablemente mantienen el SBX aniónico lo suficientemente abierto como para que el fentanilo se una mediante repulsión electrostática. Nota MD sugiere que hay poca interacción entre los extremos de carboxilato y la molécula de fentanilo, ya que los grupos cargados se orientan hacia su entorno acuoso.

Los resultados presentados hasta ahora representan una vista simplificada de los detalles estructurales de los complejos SBX:fentanilo. Como se mencionó anteriormente, los datos de RMN en forma de gráficos de trabajo (consulte la Fig. 1 en Información de respaldo), que se utilizan para determinar las estequiometrías anfitrión:huésped42,43,44, revelaron un comportamiento de unión más complejo que inicialmente se pensó que se originaba a partir de una relación 1:2. o complejo anfitrión:huésped 2:1. Sin embargo, las simulaciones de MD mostraron que el CD no podía acomodar una segunda molécula de fentanilo. Sin embargo, simulaciones adicionales mostraron que los CD cargados podían contener fentanilo en dos conformaciones distintas (Fig. 4). En el caso de SBX-1, la orientación con la mitad amida del fentanilo apuntando "hacia abajo" hacia los extremos de la cadena aniónica se ve ligeramente favorecida energéticamente sobre el fentanilo en la dirección opuesta (ver Fig. 4a). Para SBX + 1, se prefiere la configuración invertida con la mitad de la amida apuntando "hacia arriba" hacia el borde secundario no modificado del CD (ver Fig. 4b). Se observó que ambas conformaciones eran favorables, con diferencias relativamente pequeñas en energías entre ellas (0,8 a 5,8 kcal mol-1 dependiendo de la molécula huésped, Fig. 4c). Para SBX, las dos conformaciones son igualmente favorables.

Resultados MD para el complejo huésped:huésped con dos orientaciones: (a) fentanilo (átomos de carbono en cian) alineados “abajo” con la mitad de amida cerca del borde primario de SBX (átomos de carbono en verde), (b) fentanilo alternativamente, “arriba ”posición dentro de SBX, c) energías vinculantes para los tres complejos SBX.

Los hallazgos de MD son consistentes con los experimentos de RMN de espectroscopía de efecto Overhauser nuclear de marco giratorio (ROESY). La Figura 5 muestra el espectro ROESY bidimensional de una mezcla de SBX + 1:fentanilo (consulte también la Figura 3 en Información de respaldo). De particular importancia es la ausencia total de correlaciones entre los protones de metileno en el brazo de CD aniónico y los protones aromáticos en el anillo de fenilo unido a nitrógeno de amida. Más bien, sólo se encontraron correlaciones entre estos metilenos y los protones fenetilaromáticos del fentanilo. Este hallazgo indica que la mayoría del fentanilo se une en la orientación "arriba", lo que coincide con los resultados de MD. Los datos ROESY para una mezcla de SBX-1:fentanilo muestran una concordancia similar con los datos de MD, es decir, los protones de amida fenilo se correlacionan con los protones de CD interiores cerca de su borde secundario no modificado. Estos picos proporcionan una evidencia clara de una preferencia del complejo por adoptar la orientación "hacia abajo". Para los tres CD cargados, los datos del gráfico de trabajo (consulte los datos seleccionados en la Fig. 1 de la Información de respaldo) muestran evidencia de un sistema de unión de dos estados, independientemente de la falta de correlaciones claras en los espectros ROESY. Los gráficos de trabajo son mucho más sensibles a la hora de detectar este tipo de fenómenos, ya que cubren un rango de concentración relativa sustancialmente más amplio (es decir, relación [H]0/[G]0) que los experimentos de titulación.

Espectro ROESY parcial del complejo SBX + 1:fentanilo HCl. Las correlaciones entre los protones aromáticos de fentanilo del anillo fenetilo y los metilenos SBX + 1 están resaltados por el cuadro discontinuo. El espectro completo se muestra en la Fig. 3 de la información de respaldo.

La evidencia de una coexistencia en equilibrio de las dos conformaciones implica que el modelo de unión 1:1 invocado anteriormente no es estrictamente apropiado para la extracción de afinidades de unión en equilibrio. Por lo tanto, desarrollamos un modelo de ajuste que considera explícitamente ambas orientaciones en los datos de titulación de cambio químico. Los detalles de este modelo “autocompetitivo” se dan en la Información de respaldo. Los resultados del ajuste a dicho modelo arrojaron dos constantes de enlace de equilibrio. Para SBX:fentanilo, se observó que el mayor de los dos valores de Ka era estadísticamente similar al derivado del modelo 1:1. También se extraen las constantes de unión secundaria, indicativas del complejo más débil, pero fue posible solo con datos de titulación asignar afinidades sin ambigüedades a conformaciones particulares debido a que su población relativa asociada era tan baja. Sin embargo, la aparente concordancia de los datos de RMN ROESY con los resultados de MD parece sugerir que las conformaciones dominantes establecidas a partir de los datos de RMN son aquellas con las energías calculadas más altas (es decir, las más entálpicamente favorables) como se muestra en la Fig. 3. Sin embargo, los parámetros de ajuste Los resultados de este ajuste físicamente más relevante son mucho menos robustos que los obtenidos con el modelo 1:1 debido al número y la alta correlación entre los parámetros de ajuste. Por esta razón, trazamos las constantes de vinculación obtenidas para el modelo 1:1 más robusto en la Fig. 1 (siendo SBX + 1 la excepción ya que los datos no se pudieron ajustar razonablemente bien con el modelo simple).

Los reactivos y disolventes se compraron y utilizaron tal como se recibieron. El 3-mercaptopropionato de metilo, el carbonato de cesio y el 2-mercaptoetano-1-ol se adquirieron de Alfa Aesar (Ward Hill, MA). El tioglicolato de metilo se adquirió de Pfaltz and Bauer, Inc. (Waterbury, CT). El 4-sulfanilbutanoato de metilo se adquirió de Enamine Ltd. (Kiev, Ucrania). La N-metil-2-pirrolidona se adquirió de Applied Biosystems, Thermo Fisher (Grand Island, NY). El 4-mercaptobutan-1-ol y el 3-mercaptopropan-1-ol se sintetizaron como se describió anteriormente45,46, se purificaron mediante cromatografía en columna ultrarrápida en cartuchos de gel de sílice con un sistema de purificación Biotage Isolera y se evaluó su pureza mediante 1H NMR y GC-MS47. 48,49. El agua deuterada (D2O) se adquirió de Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Tewksbury, MA). Las ciclodextrinas bromadas con hexakis, heptakis y octakis-C6 se adquirieron en Arachem/Cyclodextrin Shop (Tilberg, Países Bajos). Las reacciones de desplazamiento mediadas por tiol en las ciclodextrinas C6 perbromadas seguidas de hidrólisis de éster metílico (cuando corresponda) se lograron con una versión modificada del protocolo publicado originalmente por Adam et al36. Para la síntesis de intermedios de éster metílico del ácido mercaptoalquilcarboxílico, se utilizó cromatografía en capa fina (TLC) para controlar su producción utilizando láminas Merck kieselgel 60-F254 y la detección se realizó con luz ultravioleta (λ = 254 nm) junto con el desarrollo de color con Ce( SO4)2/(NH4)6Mo7O24·4H2O/H2SO4/H2O (CAM)50,51,52,53 y vapor de yodo54,55,56. La centrifugación se realizó en una centrífuga Eppendorf modelo 5810R a 3220 rpm durante 5 min, utilizando tubos Falcon (50 ml) adquiridos en VWR (Aurora, CO.). Los disolventes se eliminaron utilizando un evaporador rotatorio modelo IKA RV8 acoplado a una bomba de filtración al vacío KNF-Lab y un sistema de refrigeración/circulación VWR RS-232 (agua a 9 °C/etilenglicol 1:1).

Los espectros de RMN 1H (600 MHz), RMN 13C (150 MHz) y RMN 13C-DEPT (150 MHz) se registraron en D2O a menos que se especifique lo contrario. Los espectros se obtuvieron utilizando un instrumento Bruker Avance III de 600 MHz equipado con una criosonda Bruker TCI de 5 mm (Bruker Biospin, Billerica, MA) a 30,0 ± 0,1 °C. Los datos de RMN para los compuestos sintetizados que se detallan a continuación se informan de la siguiente manera: desplazamiento químico (δ) (partes por millón, ppm); multiplicidad: s (singlete), d (doblete), t (triplete), dd (doblete de dobletes), td (triplete de dobletes), m (multiplete), app (aparente) y br (amplio); Las constantes de acoplamiento (J) se dan en Hercios (Hz). Para los datos experimentales utilizados en la caracterización de los complejos huésped:huésped, se recogieron datos de RMN 1H unidimensional con supresión de agua mediante escultura de excitación con gradientes57. Para cada experimento 1-D, se recogieron de 16 a 128 transitorios (dependiendo de la concentración del analito) utilizando 65.536 puntos de datos, un tiempo de adquisición de 4,0 s y un retraso de relajación de 1,0 s. Antes de la transformación de Fourier, las desintegraciones de inducción libre (FID) se apodizaron con una desintegración exponencial equivalente a un ensanchamiento de línea de 0,25 Hz. Se adquirieron espectros ROESY bidimensionales utilizando 16.384 puntos de datos con 1.024 incrementos, de 8 a 32 escaneos para cada incremento y un bloqueo de giro de onda continua con un tiempo de mezcla de 200 ms y una frecuencia de 3,57 kHz. Se pueden encontrar más detalles en nuestra publicación anterior25. Las masas exactas de los compuestos sintetizados a continuación se obtuvieron en un Bruker micrOTOF-Q III (Bruker Daltonics, Billerica, MA) equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI). La detección espectroscópica de masas de tiempo de vuelo se realizó en modo de iones negativos. La calibración de masas se realizó en los minutos finales de cada análisis utilizando la mezcla de ajuste de baja concentración ESI-L de Agilent (G1969-85,000). Para la separación de todos los compuestos se utilizó un cromatógrafo líquido (LC) Agilent 1260 equipado con una columna de fase inversa Atlantis T3 (C18, 150 mm x 2,1 mm, tamaño de partícula de 3 μm, Waters, Milford, MA). La fase móvil de LC consistió en agua con 0,1% de ácido fórmico (A) y acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico (B). El perfil de gradiente comenzó con 95 % de A durante 2 min, aumentó hasta 5 % de A a los 18 min, se mantuvo durante 13,5 min, volvió a aumentar rápidamente hasta 95 % durante 0,5 min y se mantuvo durante 10 min para la regeneración de la columna. Este método se utilizó para todas las muestras excepto aquellas para el estudio de la superficie de losetas de vinilo, para las cuales el 5% A final se mantuvo durante 18,5 minutos. Se introdujeron diez microlitros de la muestra líquida mediante un muestreador automático (Agilent B1329B) en el puerto de inyección.

Las constantes de unión de equilibrio entre la familia CD y el fentanilo HCl se determinaron mediante experimentos de valoración por RMN 1H. Para derivar la constante de unión más precisa, la concentración de ciclodextrina [H]T (en unidades de M) satisfizo la desigualdad [H]TK <1 siempre que fue posible. Los estudios iniciales requirieron estimaciones aproximadas de K ya que a priori eran desconocidas. En última instancia, esta condición se cumplió para todos los compuestos excepto para SBX + 1, donde la concentración requerida produjo una relación señal-ruido inaceptable. El uso de esta concentración no ideal conduce a una mayor incertidumbre en la constante de unión derivada (vide infra). Debido a las solubilidades acuosas limitadas de los compuestos neutros 5–7 (< 1 mg·mL-1 en todos los casos), todas las valoraciones se realizaron a [H]T < 0,1 mM. Cada una de las CD modificadas se disolvió en agua deuterada (D2O) hasta un volumen total de 500 μL con 1 μL de acetonitrilo agregado como punto de referencia de desplazamiento químico. Luego se tituló fentanilo HCl en la solución. La concentración total de fentanilo HCl (unido a ciclodextrina + libre en solución) [G]T (en unidades de M) se varió para cubrir el rango de concentraciones entre \(\frac{\left(0.2{\left[H\right] }_{T}+0.25\right)}{K}\) y \(\frac{\left(0.8{\left[H\right]}_{T}+4\right)}{K}\) para permitir una extracción precisa de las constantes vinculantes. En cada punto de titulación, se registraron los desplazamientos químicos de los protones (referidos al acetonitrilo a 2,014 ppm) de los protones H1, H3, H5 y H6 en el CD; la resta del desplazamiento químico obtenido del primer punto de datos, que consiste solo en la ciclodextrina, produjo una diferencia entre el desplazamiento químico unido y libre \(\Delta {\delta }_{i}\) para cada uno de los protones indicadores i. Las curvas resultantes de \(\Delta {\delta }_{i}\) versus [G]T se ajustaron inicialmente (Mathematica 10, Wolfram) usando un algoritmo de mínimos cuadrados no lineal discutido anteriormente (ver detalles matemáticos adicionales en Soporte Información)31. Como en nuestro trabajo anterior, la constante de unión K y un factor de sensibilidad al desplazamiento químico \(\Delta {\updelta }_{c,i}\) para cada protón informador son los parámetros de ajuste. Restringir K a un valor único para cada curva de titulación de RMN produce una constante de unión global que incorpora datos de todos los protones informadores58. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Los valores informados de K para cada compuesto son el promedio y la desviación estándar en los tres experimentos.

La dinámica molecular (MD) se realizó con AMBER59 (versión 12) empleando las cargas y parámetros recientes aplicados para los andamios de ciclodextrina60,61 y el campo de fuerza GAFF para los diversos fentanilos62 en sus estados protonados63. Las cargas de fentanilo se generaron mediante cálculos AM1-BCC55 en el programa ANTECHAMBER. Se empleó el programa CHIMERA para modelar los procesos de complejación CD:fentanilo64. Los complejos CD y CD:fentanilo se solvataron en una caja de agua TIP3P de tamaño suficiente para tener al menos 15 Å de agua entre el soluto y la interfaz del disolvente (~ 51 × 51 × 51 Å3 tamaño inicial de la caja)65. Para neutralizar los sistemas, se agregaron al sistema suficientes iones de sodio (Na+) (normalmente uno). Los sistemas constaban de unos 12.500 átomos (~ 4.100 moléculas de agua). Se minimizó la energía de cada sistema utilizando 250 pasos de descenso más pronunciado y 1500 pasos de gradiente conjugado. En estos sistemas minimizados se realizaron dinámicas de temperatura y presión constantes (NPT)66,67. Se utilizaron condiciones de contorno periódicas y las interacciones electrostáticas se trataron mediante métodos de Ewald de malla de partículas utilizando un corte de 9 Å en el espacio directo con una rejilla de 1 Å68. Los enlaces que contienen hidrógeno se restringieron usando SHAKE y se usó un paso de tiempo de 2 fs para cada simulación69. Inicialmente, los sistemas se acoplaron a un baño térmico a 100 K durante los primeros 100 ps, ​​luego se aumentaron a 200 K durante los siguientes 100 ps y finalmente se elevaron a 300 K durante el resto de la simulación. Cada simulación se realizó durante un total de 10 ns o 30 ns según el CD invitado. Las simulaciones iniciales involucraron solo trayectorias únicas, pero se observó universalmente que la estructura βCD no cambió significativamente durante la simulación, y que la desviación cuadrática media de los átomos que no son de hidrógeno en relación con la estructura promedio se estabilizó rápidamente en 1 ns. Los primeros 2,5 ns de la dinámica de 300 K se utilizaron para el equilibrio. Para obtener datos e información estadística más completos, se realizaron diez simulaciones replicadas (10 ns cada una) para complejos entre los cuatro fentanilos cargados y βCD donde la molécula invitada era paralela al borde más ancho del CD. Estas simulaciones replicadas se caracterizaron por cambiar el valor inicial para generar las velocidades iniciales del sistema.

La energía libre de unión entre las ciclodextrinas y los fentanilos se estimó utilizando el método de área de superficie de nacimiento generalizada de mecánica molecular (MM-GBSA) a partir de instantáneas de las trayectorias solvatadas70,71,72,73. Los cálculos de energía de MM-GBSA se realizaron en simulaciones repetidas y luego se promediaron para obtener la energía de enlace promedio para un sistema particular de fentanilo:CD. La energía libre de enlace se estimó mediante la ecuación:

Si fuera cada término, G se estima como la suma de la energía de la mecánica molecular en fase gaseosa Egas y la energía de solvatación Gsol:

En estos cálculos de energía libre se despreció la contribución de la entropía. La energía libre de solvatación (Gsol) es la suma de las energías de solvatación polares y no polares de las moléculas determinada resolviendo la ecuación de Born generalizada (GB). Las energías libres de enlace para los complejos se calcularon utilizando el script MMPBSA.py en AMBER12 en instantáneas de cada trayectoria de 7,5 ns. Para el cálculo se utilizó el modelo modificado Onufriev-Bashford-Case-I GB (ib = 2) con una concentración de sal de fentanilo de 0,24 mM74. La tensión superficial utilizada para calcular la contribución no polar a la energía libre de solvatación fue 0,0072 kcal mol-1 Å-2.

En este trabajo, hemos estudiado los complejos de inclusión entre una serie de CD modificadas químicamente con el opioide sintético fentanilo. El panel evaluado de CD exhibió cadenas laterales de ácido tioalquilcarboxílico aniónico o cadenas laterales de alcoholes de tioalquilo neutros en su borde superior. Se descubrió que los CD cargados tenían interiores hidrófobos extendidos que se mantenían abiertos mediante repulsión electrostática mutua de las cadenas laterales, proporcionando así una bolsa de unión suficiente para el opioide. Se encontró que las simulaciones MD de los complejos de inclusión SBX:fentanilo eran consistentes con las tendencias de afinidad de unión extraídas de experimentos de RMN. Es decir, la fuerza de unión aumenta a medida que aumenta la longitud del brazo modificado para los tres CD cargados estudiados. Para las CD con cadenas laterales de tioalquilo neutras, se observó que las afinidades de unión disminuyen al aumentar la longitud del brazo, probablemente como resultado de la unión competitiva de las cadenas laterales neutras más hidrófobas que también buscan los interiores hidrófobos de SBN. Las simulaciones MD también respaldaron este fenómeno de unión competitiva y revelaron que los brazos más largos tendían a interactuar más fuertemente con el interior hidrofóbico. Para el panel de SBX cargados prometedores, se encontró que la afinidad de unión máxima de fentanilo era Ka = 66,500 M-1 para SBX + 1. Hasta donde sabemos, esta es la mayor afinidad de unión de equilibrio reportada para los complejos CD:fentanilo. Creemos que estos andamios de CD podrían convertirse en candidatos a contramedidas médicas novedosas y prometedoras contra estos opioides potencialmente mortales. Otra vía importante para investigaciones futuras, pero que no está cubierta actualmente: el poder potencial de ajustar simultáneamente el gráfico de trabajo y los datos de titulación para extraer valores más confiables de parámetros de ajuste altamente correlacionados. Nuestro grupo también se centra en la explotación de estos compuestos para la eliminación ambiental de fentanilos, así como para la detección de estos opioides en muestras biológicas forenses complejas.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios.

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Este trabajo fue realizado bajo los auspicios del Departamento de Energía de EE. UU. por el Laboratorio Nacional Lawrence Livermore bajo el contrato DE-AC52-07NA27344. El trabajo fue financiado en su totalidad por una subvención de investigación y desarrollo dirigida por laboratorio (14-ERD-048) para CAV.

Dirección de Ciencias Físicas y Biológicas, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, Livermore, CA, 94550, EE. UU.

Brian P. Mayer, Daniel J. Kennedy, Edmond Y. Lau y Carlos A. Valdez

División de Ciencias Nucleares y Químicas, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, 7000 East Avenue, Livermore, CA, L-090 94550, EE. UU.

Brian P. Mayer, Daniel J. Kennedy, Edmond Y. Lau y Carlos A. Valdez

Centro de Ciencias Forenses, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, Livermore, CA, 94550, EE. UU.

Brian P. Mayer, Daniel J. Kennedy y Carlos A. Valdez

División de Biociencias y Biotecnología, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, Livermore, CA, 94550, EE. UU.

Edmond Y.Lau

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CAV sintetizó y purificó todos los compuestos utilizados en este trabajo. BPM y DJK realizaron todos los experimentos de RMN 1D y 2D. EYL realizó todas las simulaciones de dinámica molecular y experimentos de acoplamiento. CA V y BPM escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Carlos A. Valdez.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Mayer, BP, Kennedy, DJ, Lau, EY et al. Evaluación de ciclodextrinas polianiónicas como estructuras de unión de alta afinidad para el fentanilo. Informe científico 13, 2680 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29662-1

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Recibido: 16 de noviembre de 2022

Aceptado: 08 de febrero de 2023

Publicado: 15 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29662-1

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