Reutilización del anfitrión

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 2141 (2023) Citar este artículo

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La diversidad limitada de objetivos de las terapias con antibióticos disponibles ha ejercido una enorme presión sobre el tratamiento de patógenos bacterianos, donde cada vez son más frecuentes numerosos mecanismos de resistencia que contrarrestan su función. En este caso, utilizamos una prueba antivirulencia no convencional de macrociclos que interactúan entre huésped e huésped e identificamos un macrociclo sintético soluble en agua, el pilar[5]areno, que no es bactericida/bacteriostático y tiene un mecanismo de acción que implica la unión a ambos. homoserina lactonas y lipopolisacáridos, factores clave de virulencia en patógenos gramnegativos. Pillar[5]arene es activo contra Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii resistentes a carbapenems de máxima prioridad y a cefalosporinas de tercera/cuarta generación, suprimiendo toxinas y biopelículas y aumentando la penetración y eficacia de los antibióticos estándar en administraciones combinadas. La unión de homoserina lactonas y lipopolisacáridos también secuestra sus efectos directos como toxinas en las membranas eucariotas, neutralizando herramientas clave que promueven la colonización bacteriana e impiden las defensas inmunes, tanto in vitro como in vivo. El pilar[5]areno evade tanto los mecanismos de resistencia a los antibióticos existentes como la acumulación rápida de tolerancia/resistencia. La versatilidad de la química macrocíclica huésped-huésped proporciona amplias estrategias para abordar la virulencia a medida en una amplia gama de enfermedades infecciosas gramnegativas.

El alcance de los objetivos antibióticos actuales es muy limitado, y la gran mayoría de los tratamientos aprobados se dirigen a la síntesis de ADN, la síntesis de proteínas, la integridad de la membrana o la biosíntesis de la pared celular, todos los cuales se ven contrarrestados por numerosos mecanismos de resistencia cada vez más prevalentes. La inminente crisis sanitaria mundial resultante ha sido documentada desde varias perspectivas en informes recientes1,2,3 y ha llevado a la Organización Mundial de la Salud a crear una lista de patógenos prioritarios. Las bacterias gramnegativas, que tienen una membrana externa (MO) que actúa como una barrera formidable contra una gran cantidad de antibióticos de tratamiento estándar, representan la mayoría de los patógenos en la lista de prioridades4, junto con Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenémicos. Destacando en la cima5. Este apremiante desafío global enfatiza la necesidad de descubrir terapias con estructuras moleculares y/o mecanismos de acción únicos que evadan los mecanismos de resistencia existentes y tengan menos probabilidades de generar resistencia a los medicamentos6.

Una alternativa prometedora al alcance limitado de los antibióticos es atacar los factores de virulencia bacteriana, que desempeñan un papel crucial en el establecimiento y la progresión de las infecciones6. Los objetivos potenciales incluyen toxinas formadoras de poros7, moléculas de señalización de homoserina lactona8,9,10, biopelículas bacterianas11,12, quelación de metales13 y la OM bacteriana14. Los químicos supramoleculares exploran intensamente las moléculas que contienen cavidades macrocíclicas en la química huésped-huésped, debido a sus preferencias moleculares sintonizables. Específicamente, las diferentes preferencias estéricas y conformacionales permiten la encapsulación diferencial de huéspedes específicos dentro de sus cavidades internas15. La estructura central también se puede modificar o mejorar fácilmente con grupos funcionales para agregar funcionalidades secundarias16, surgiendo varios ejemplos de interacciones simultáneas17,18. Esfuerzos recientes también han explorado la aplicación de macrociclos funcionalizados hacia terapias antibacterianas, tanto para patógenos Gram positivos19 como Gram negativos20, incluidos compuestos dirigidos a biopelículas21. Sin embargo, la relación entre estructura, función y mecanismo de acción sigue siendo poco conocida.

Las lactonas homoserinas (HSL) son pequeñas moléculas señal difusibles producidas, liberadas y detectadas por bacterias Gram negativas en un proceso llamado detección de quórum (QS) y se utilizan para coordinar respuestas en toda la colonia, incluida la formación de biopelículas, la producción de exotoxinas y tensioactivos, la motilidad. y moléculas captadoras de nutrientes22,23. Como tales, constituyen un objetivo atractivo para estrategias antivirulencia y se han explorado previamente como tales24,25. Los lipopolisacáridos (LPS) forman un componente importante de la valva externa de la MO en las bacterias gramnegativas, presentándose como una barrera formidable contra los antibióticos intracelulares26.

En este trabajo, exploramos las interacciones entre el macrociclo sintético Pillar[5]areno (P[5]a) y dos factores de virulencia distintos: HSL y LPS. Investigamos la interacción entre P[5]a y HSL y cómo esto desactiva las respuestas controladas por virulencia en patógenos bacterianos. De manera similar, estudiamos las interacciones entre P[5]a y LPS y cómo esto afecta la función de LPS en la membrana externa, lo que resulta en una mayor penetración de antibióticos a través de la barrera OM. En conjunto, investigamos cómo P[5]a suprime la virulencia bacteriana en aislados ampliamente resistentes a los medicamentos y observamos que, en ausencia de factores de virulencia, la viabilidad de las células epiteliales pulmonares se recupera dramáticamente. Las interacciones combinadas de P[5]a con factores de virulencia bacteriana proporcionan una estrategia prometedora contra las infecciones resistentes a los antibióticos, ya sea solas o en combinación con los antibióticos habituales.

Para identificar posibles interacciones huésped-huésped entre los macrociclos que contienen cavidades y las moléculas de señalización bacteriana, configuramos una evaluación no convencional de un conjunto de macrociclos (Tabla complementaria 1) para determinar la afinidad con seis HSL diferentes (Fig. 1a, b). Aunque esfuerzos anteriores ya establecieron un vínculo entre el tamaño de la cavidad interna y la afinidad de unión9, se sabe poco en relación con las afinidades, preferencias y determinantes de las interacciones huésped-huésped con las HSL. Para obtener una mejor comprensión, y asumiendo que el tamaño de su cavidad juega un papel importante en la determinación de la afinidad por HSL, se seleccionaron tipos de macrociclos muy variados, principalmente para representar una amplia gama de tamaños de cavidades internas (1,5 – 11,7 Å) y pesos moleculares (172 – 2,260 g/mol). De manera similar, se seleccionaron HSL para representar diversidad en sus cadenas de acilo, incluido un carbono ramificado, grupos carboxilo y grupos hidroxilo. También analizamos la unión a pC HSL, que contiene un parafenol terminal.

a Esquema de la interacción entre “huéspedes” macrocíclicos con “huéspedes” HSL. b Las estructuras moleculares, los nombres abreviados y las especies bacterianas de todos los QS HSL utilizados en este estudio. c Representación esquemática de la detección de quórum HSL en bacterias Gram negativas (izquierda), junto con un enfoque de inhibición de la virulencia (derecha). En resumen, las HSL producidas por individuos seleccionados se difunden libremente a través de las membranas externa e interna y son detectadas por proteínas receptoras intracelulares en otros miembros de la comunidad, promoviendo la producción de HSL isogénica y una regulación sincronizada de actividades. Estrategia de inhibición de virulencia aplicada, donde la interacción entre las HSL y el huésped macrocíclico impide el reconocimiento de las HSL por su receptor afín. d La detección de la interacción entre las HSL como se ve en (b) y un conjunto de macrociclos revela varias combinaciones en las que el macrociclo interactúa con la HSL y donde la tasa de crecimiento en E. coli (I1/I0 OD600) permanece prácticamente sin verse afectada (umbral, gris líneas discontinuas, ±20%). La interacción se detecta a través de un biosensor HSL, donde se expresa el receptor afín y la región de unión del promotor se fusiona con GFP. Las interacciones entre macrociclos y HSL se observan mediante una disminución de la afinidad (I1/I0). Los efectos dependientes de la concentración del macrociclo que interactúa más fuerte, P[5]a, sobre la expresión fluorescente en E. coli para cada una de las seis HSL, indican una mayor afinidad hacia las HSL con cadenas de acilo más largas. Los datos representan valores promedio de réplicas biológicas ± sd (n = 3 por grupo). f Efecto de P[5]a sobre la tasa de crecimiento y viabilidad de E. coli. E. coli incubada con la concentración más alta probada de P[5]a, 2,5 mM, muestra una curva de crecimiento estándar, que incluye fase retardada, logarítmica y estacionaria. Una evaluación de la viabilidad bacteriana de BacLight muestra la viabilidad celular en todas las concentraciones probadas de P[5]a después de 24 h de exposición y sin muerte celular dependiente de la concentración. Los datos representan valores promedio de réplicas biológicas ± sd (n = 3 por grupo).

Para la detección, desarrollamos un sistema indicador de E. coli fluorescente capaz de detectar seis HSL diferentes. Cada receptor se dimeriza y se une al promotor vinculado a EGFP tras la adición de su HSL afín (Fig. 1c, Fig. 1 complementaria, Tabla complementaria 2). Seleccionamos inhibidores de virulencia macrocíclicos con una fuerte relación de señal para cada uno de los HSL (fluorescencia I1/I0) y efectos mínimos sobre la viabilidad bacteriana y la tasa de crecimiento (densidad óptica I1/I0, ± 20%, líneas discontinuas grises). Identificamos varias combinaciones de interés de macrociclo-HSL con una relación de señal de fluorescencia superior al 50% y efectos mínimos sobre la tasa de crecimiento, resaltadas en círculos azules (Fig. 1d, Fig. Suplementaria 1a-e). Todas las combinaciones huésped-huésped con mayor unión se encuentran dentro de un rango limitado de tamaños de cavidad interna, desde 3 Å para 4-sulfocalix[4]areno (4-Sc[4]a) hasta 7,8 Å para β-ciclodextrina (β-CD ), lo que sugiere que la cavidad interna desempeña un papel en la unión. Entre los macrociclos probados, P[5]a mostró la relación de señal dependiente de la concentración más alta. Aunque P[5]a muestra unión con las seis HSL, varía desde casi ninguna unión con la HSL C4 (18%), con una cadena de acilo muy corta, hasta una fuerte unión con la 3-oxo-C12 (64%). y 3:OH:C14 HSL (96%), ambos con cadenas de acilo prolongadas (Fig. 1e).

P[5]a no tuvo ningún efecto observable sobre la tasa de crecimiento en E. coli y una evaluación de viabilidad después de 24 h de crecimiento muestra que todas las concentraciones probadas (hasta 2,5 mM) fueron bien toleradas (Fig. 1f, Fig. complementaria 2a-e ). Una observación más de cerca de la estructura de P [5] a (Fig. 2a) muestra que es un pilar [5] areno modificado con un núcleo lipófilo y una periferia hidrófila. Contiene una cavidad hidrófoba (4,6 Å) y un borde policatiónico sustituido simétricamente. La microscopía de fluorescencia y el análisis de citometría de flujo muestran que en una comunidad microbiana combinada, que consta de cuatro cepas sensoras de E. coli, cada una con una proteína fluorescente única que detecta una HSL diferente, P[5]a se une selectivamente a la HSL 3-OH-C14:1. con una cadena de acilo alargada, lo que resulta en una reducción de 102 en la fluorescencia de la cepa del sensor pCin-EGFP (Fig. 2b-d). Por el contrario, la expresión de las otras tres cepas sensoras no se vio afectada en gran medida por la adición de P[5]a, lo que sugiere que las interacciones huésped-huésped podrían utilizarse para atacar específicamente bacterias con cadenas de acilo más largas. Proponemos que la selectividad puede ser un enfoque beneficioso para atacar los patógenos de manera más específica en comparación con la actividad antibiótica de amplio espectro. En diversos entornos, como el microbioma humano, una comunidad intestinal microbiana diversa es esencial para la salud de su huésped. El tratamiento con antibióticos puede tener un impacto perjudicial en la diversidad del microbioma, deteriorando la salud general del huésped y al mismo tiempo dejándolo mucho más vulnerable a las infecciones por Clostridium difficile.

a Estructura química del huésped sintético P[5]a que demostró la interacción más fuerte con HSL con cadenas de acilo más largas, destacando la cavidad central hidrófoba (cuadro marrón), flanqueada en ambos lados por los residuos hidrófilos policatiónicos (cuadros naranjas). b Esquema de una comunidad microbiana combinada, donde P[5]a inhibe específicamente cepas que utilizan HSL con cadenas de acilo más largas para la comunicación y sincronización, como se ve en (c) y (d). c Imágenes de microscopía de fluorescencia de una comunidad microbiana combinada de células de E. coli que consta de cuatro cepas diferentes con una proteína fluorescente única (pRhl-mKO2 naranja para C4, pLux-CFP cian para 3-oxo-C6, pCin-GFP verde para 3- OH-C14:1 y pRpa-mCherry red para pC HSL) que detectan cada uno una HSL diferente, demuestran que P[5]a interactúa específica y preferentemente con HSL que contienen cadenas de acilo más largas. La adición de P[5]a da como resultado la inhibición de pCin-GFP, detectando la cadena larga 3-OH-C14:1 HSL. Imágenes representativas de valores promedio de réplicas biológicas ± sd (n = 3 por grupo). Barra de escala, 50 µm. d Análisis de citometría de flujo en el cultivo microbiano combinado en (i), que confirma la inhibición específica de pCin-GFP (detección de 3-OH-C14:1 HSL) tras la adición de P[5]a, indicada por la flecha negra. Se agregó un desplazamiento en el eje y para mayor claridad. e P[5]a suprime la toxina bacteriana piocianina, una toxina clave en P. aeruginosa controlada por la detección de quórum HSL, en PAO1 después de un cultivo agitado de 24 h. Los datos representan valores promedio de réplicas biológicas ± sd (n = 4 por grupo). f P[5]a suprime la formación de biopelícula en PAO1 después de un cultivo estático de 24 h. Los datos representan valores promedio de réplicas biológicas ± sd (n = 3 por grupo). g P[5]a suprime la formación de biopelículas en aislados clínicos MDR de “superbacterias” de P. aeruginosa después de un cultivo estático de 24 h. Los datos representan valores promedio de réplicas biológicas ± sd (n = 3 por grupo). h P[5]a suprime la formación de biopelículas en aislados clínicos MDR de “superbacterias” de A. baumannii después de un cultivo estático de 72 h. Los datos representan valores promedio de réplicas biológicas ± sd (n = 3 por grupo).

Para comprender las posibles implicaciones de las interacciones huésped-huésped entre los macrociclos y las HSL en un contexto biológico, continuamos la validación contra P. aeruginosa y A. baumannii clínicamente relevantes, que despliegan HSL de cadena larga (Fig. 2b). Un extenso trabajo previo sobre estos patógenos ha dilucidado la función de las HSL en QS, un mecanismo regulador esencial de la virulencia colectiva en estos patógenos27,28,29. Seleccionamos los macrociclos que mostraron la mayor afinidad (es decir, P[5]a, α-ciclodextrina (α-CD), β-CD y 4-Sc[4]a), por sus efectos sobre la producción de piocianina en Aislado de P. aeruginosa PAO1. La piocianina es una exotoxina con un color verde fuerte observable que está bajo regulación directa de QS, utilizada como medida sustituta de virulencia (Fig. 2e). La adición de P[5]a resultó en una reducción dependiente de la concentración en los niveles de piocianina, comenzando con concentraciones de P[5]a tan bajas como 10 µM, con supresión completa a 1 mM y superiores. Por el contrario, los macrociclos α-CD, β-CD y 4-Sc[4]a no tuvieron efecto sobre los niveles de piocianina (Figuras complementarias 3a-c). La incubación de macrociclos con piocianina purificada confirma que P [5] a inhibe la producción de piocianina en lugar de interactuar con las moléculas de toxina existentes (Figura complementaria 3d). Los efectos dependientes de la concentración de P [5] a sobre la producción de piocianina en PAO1 se correlacionan fuertemente con los efectos de P [5] a en el biosensor de detección de quórum en E. coli (Figura complementaria 3e).

P [5] a tuvo efectos comparables sobre la formación de biopelículas en PAO1, también fuertemente asociado con QS regulado por HSL, como lo indica la tinción púrpura (violeta cristal), con una dependencia de la concentración similar a la observada en la evaluación de piocianina (Fig. 2f). . Debido a la creciente presión de la resistencia a la terapia con antibióticos, probamos la efectividad contra aislados de Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii resistentes a carbapenémicos y cefalosporinas de tercera/cuarta generación (Fig. 2g, h y Datos complementarios 1). En todos los casos, observamos una disminución estadísticamente significativa en la formación de biopelículas. La efectividad de P [5] a contra las cepas P. aeruginosa 2798 y A. baumannii 5542, 5707 y 5568 (Fig. 2g, h) es de particular importancia, ya que estos patógenos "superbacterias" son resistentes a casi todos los tratamientos clínicos (Suplementario Datos 1).

Para confirmar que las respuestas de inhibición de la virulencia observadas son el resultado de las interacciones entre P[5]a y las HSL dentro de la cavidad central, y para aclarar las preferencias observadas por las HSL de ramificación larga, utilizamos un ensayo de desplazamiento de tinte ( Figura 3a)30. La unión de naranja de metileno (MO) a P[5]a da como resultado un cambio del máximo de absorción de 470 nm a 392 nm, como se informó (Fig. 3b, izquierda) 18,31 La adición posterior de HSL libera el MO por acción competitiva. encuadernación (Fig. 3b, derecha). La recuperación resultante de la absorción de MO a 470 nm permite determinar la afinidad de unión de HSL-P [5] a (Figuras complementarias 4a-c).

a Representación esquemática del ensayo de desplazamiento de tinte, que muestra la interacción objetivo P[5]a-HSL (k1), la formación del complejo P[5]a-MO (k2) y el ensayo de desplazamiento de tinte medido (k3). b Izquierda: cambio en los espectros de absorción de MO (2,0 µM) titulado con cantidades crecientes de P[5]a (es decir, k2). Derecha: la titulación de cantidades crecientes de 3-oxo-C12 HSL desplaza el MO dentro de la cavidad de P[5]a, lo que resulta en una recuperación del espectro de absorción (es decir, k3). c Densidad óptica medida a 470 nm de complejos P[5]a-MO (concentración de P[5]a = 10 µM, concentración de MO = 2,0 µM, concentración de NaCl = 50 mM), titulada frente a concentraciones crecientes de la HSL correspondiente (puntos ). Los datos representan valores promedio ± sd (n = 3 muestras biológicamente independientes por grupo). d Izquierda: espectros de absorción de MO (2,0 μM) titulados con cantidades crecientes de P[5]a (k2) en 0 y 50 mM de NaCl. Derecha: espectros de absorción del complejo P[5]a-MO titulado con las HSL 3-oxo-C8 y 3-oxo-C12 (k3) en NaCl 0 y 50 mM. Los datos representan valores promedio ± sd (n = 3 muestras biológicamente independientes por grupo). Las flechas indican la relación P[5]a/MO seleccionada para cada titulación de HSL (1:1 y 5:1, respectivamente). e Espectros de RMN (D2O/[D6]DMSO 30 % a 310 K) de P[5]a, los HSL 3-OH-C14:1, 3-Oxo-C12, 3-Oxo-C6 y C4, y P[ 5]a combinado con cada HSL. f La densidad electrónica de la superficie combinada de P[5]a complejada con HSL 3-OH-C14:1, 3-Oxo-C12 y 3-Oxo-C6. g Los mapas hidrofóbicos/fílicos resaltan la forma y extensión de las superficies hidrofílicas e hidrofóbicas de P[5]a de forma aislada, así como en 3-OH-C14:1, 3-Oxo-C12 y 3-Oxo-C6. h Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) frente a conjuntos de genes KEGG y GO, realizado en ARNm secuenciado de PAO1 tratado con P[5]a. i Localización de productos de ARNm. El número de productos de ARNm por grupo de localización varía desde el citoplasma hasta el periplasma 27, 93, 17, 16, 16 y 12 respectivamente. Los diagramas de caja muestran la mediana (línea central), los cuantiles superior e inferior (caja) y el rango de los datos (bigotes).

Se determinó la constante de disociación (kD) entre P[5]a y las HSL, lo que nos permitió clasificar la afinidad de unión de las HSL en la cavidad de P[5]a (3OH-C14:1 ≥ 3-oxo-C12 > 3- oxo-C8»3-oxo-C6~pC~C4) (Fig. 3c, Tabla 1, Fig. complementaria 5). Esto está de acuerdo con la disminución de la hidrofobicidad esperada por la disminución en la longitud de la cadena de acilo, como se observa en la Fig. 1e. La adición de NaCl afectó las constantes de asociación entre MO y P [5] a, mientras que las constantes de disociación entre P [5] a y las HSL no se vieron afectadas (Fig. 3c, Tabla 1, Fig. Suplementaria 6c). Esto sugiere que las interacciones electrostáticas no influyen en la unión de los huéspedes dentro de la cavidad central.

Para comprender mejor qué interacciones químicas están involucradas y cómo las características estructurales influyen en las preferencias de unión, utilizamos RMN (Fig. 3e). Los resultados de 1H NMR confirman la interacción más fuerte con las HSL más largas 3-Oxo-C12 y 3-OH-C14:1, lo que confirma la formación de complejos. Se observaron cambios mínimos en C4 y pC HSL en presencia de P [5] a, lo que sugiere una interacción débil o nula (Fig. 3e, Fig. 6 complementaria).

Utilizamos el modelado de la teoría funcional de la densidad (M06-2X) 32 para visualizar la interacción HSL-P [5] a (Fig. 3f). Las áreas superficiales de unión totales fueron generalmente proporcionales a la afinidad. La gran diferencia en el volumen de la cadena alquílica entre 3-oxo-C12 y 3-Oxo-C6 (70,5 frente a 6,3 Å) se correlacionaba con su afinidad relativa. La larga cadena hidrófoba 3-Oxo-C12 reside en la cavidad interna de P [5] a, lo que lo convierte en el complejo más estable (Figuras complementarias 7a, b). Además, estos HSL mostraron poca o ninguna alteración de la geometría o electrónica preferida de la cavidad del huésped, lo que resalta la complementariedad (Fig. 3g, Fig. 8 complementaria). En particular, la presencia de carboxilo, hidroxilo o la ausencia de grupos funcionales no tuvo un efecto impactante sobre las afinidades de unión, además de afectar la longitud de la cadena de acilo. Esto indica además que las afinidades de unión están determinadas en gran medida por la longitud y la hidrofobicidad de la longitud de la cadena de acilo.

A continuación, analizamos la transcripción diferencial del ARNm total en PAO1 tratada y no tratada con P [5] para obtener más información sobre el modo de acción (Fig. 3h). El enriquecimiento del conjunto de genes utilizando los términos de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) y de Ontología genética (GO) reveló una fuerte regulación negativa de los factores asociados a la virulencia, incluida la formación de biopelículas, QS y biosíntesis de pioverdina. La localización de los productos proteicos muestra la mayor regulación negativa en los productos dirigidos al espacio extracelular y las vesículas OM, los cuales están fuertemente asociados con factores virulentos en P. aeruginosa, incluidos LPS, exotoxinas, proteasas y elastasas, y componentes esenciales en las primeras etapas. de las infecciones y su progresión (Fig. 3i)33. También observamos una regulación positiva en sistemas de dos componentes, componentes integrales de membrana y conjuntos de genes de membrana, lo que indica una interacción de efectos causados ​​por P[5]a en la superficie de OM. Esto está en línea con caracterizaciones previas de compuestos catiónicos y péptidos, donde se especula que los residuos cargados positivamente interactúan con lípidos cargados negativamente34,35.

Dados los efectos de P [5] a sobre la membrana bacteriana (Fig. 3h, i) y su carga neta positiva, planteamos la hipótesis de una posible interacción con LPS. El LPS es un componente clave en la OM bacteriana cuyos grupos fosfato contribuyen a la carga negativa general de la superficie de la membrana. La dispersión dinámica de la luz (DLS) muestra que la titulación de LPS purificado con concentraciones crecientes de P [5] a en agua da como resultado la formación de complejos más grandes, comenzando en 15 µM y llegando a una meseta de 40 µM (Fig. 4a). La titulación de estos complejos en agua con NaCl invierte y rompe los complejos más grandes, lo que confirma que las interacciones de carga superficial son una fuerza impulsora en la formación de complejos (Fig. 4b, c)36. Sin embargo, dado que la mayoría de las condiciones fisiológicas ocurren en niveles relativamente altos de sal, lo que dificulta las interacciones de carga superficial, exploramos la titulación de LPS con P[5]a en tampones de sal fisiológica 0,5x y 1x PBS. A partir de 50 µM en PBS 0,5x y 1x, observamos un aumento continuo en la presencia de grandes complejos. Estudiamos más a fondo la interacción P [5] a-LPS en ambientes con alto contenido de sal (1x PBS) utilizando ultracentrifugación analítica (AUC), para comprender mejor los complejos formados (Fig. 4d). P[5]a y LPS por separado requirieron altas velocidades de rotación de 60.000 RPM para lograr una sedimentación detectable. Las mezclas de P[5]a-LPS dieron como resultado una sedimentación rápida a velocidades tan bajas como 25.000 RPM, lo que sugiere la formación de complejos/agregados más grandes (Figuras complementarias 9a-c). Las mezclas de P[5]a-LPS mostraron diferencias notables en la velocidad de sedimentación de estos complejos, como se observa en el rango del coeficiente de sedimentación de 3 a 100 S. Este rango corresponde a pesos moleculares que van desde 5 × 103 hasta 1 × 106 Da.

una solución de P[5]a titulada en 0,1 mg/ml de PA10 LPS (5-10 µM) en agua con DLS muestra la formación y ensamblaje de grandes complejos a partir de 15 µM de P[5]a. Los datos representan valores promedio ± sd (n = 3 experimentos independientes por grupo). La expansión resalta la formación de complejos P[5]a-LPS en condiciones fisiológicas de 0,5x y 1x. b La interacción y agregación observadas en (a) es reversible mediante la adición de sal (NaCl), lo que conduce a la disociación de los complejos más grandes. Los datos representan valores promedio ± sd (n = 3 experimentos independientes por grupo). c Representación esquemática de los efectos del NaCl en la complejación de P[5]a-LPS. d La ultracentrifugación analítica muestra el coeficiente de sedimentación de P[5]a solo a la izquierda a 60.000 rpm y P[5]a con LPS de PA10 a la derecha a 25.000 rpm, revelando la presencia de estructuras de alto peso molecular, de hasta 1 ×106 Da. La expansión destaca que la mayoría del LPS, 91%, está presente en los complejos más grandes de P[5]a-LPS (n = 1 experimento independiente por grupo). e P[5]a mejora la eficacia de los antibióticos coadministrados amikacina, cefepima, ceftazidima y meropenem en seis aislados clínicos de P. aeruginosa resistentes a MDR. Valores de CIM según el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI):37 susceptible (por debajo de la línea amarilla), susceptible intermedia (entre la línea amarilla y roja) y resistente (por encima de la línea roja). f – i Pasajes seriados de PAO1 con los antibióticos aztreonam (f), cefepima (g), meropenem (h) y tobramicina (i), así como la coadministración de los antibióticos con P[5]a. La coadministración ralentizó considerablemente el desarrollo de resistencia de PAO1 al tratamiento antibiótico respectivo. Cefepima alcanzó 128 µg/ml después de cuatro días, que fue la concentración más alta de antibiótico incluido. j El tiempo promedio (d) para que PAO1 duplique el valor de CIM requerido para matar el patógeno, como se ve en (f – i), tanto en un tratamiento independiente como en un tratamiento combinado, muestra que las coadministraciones reducen el tiempo de duplicación de la resistencia. k Representación esquemática del LPS colocado en el OM (izquierda). P[5]a interactúa con LPS en la OM, probablemente afectando la estrecha organización de la OM, lo que mejora la efectividad de los antibióticos con objetivos intracelulares en una administración combinada.

Para explorar si la complejación observada con LPS afecta su función en la membrana externa, examinamos aislados clínicos con susceptibilidad reducida a los antibióticos (Datos complementarios 1). Coadministramos P [5] a con cuatro antibióticos estándar con objetivos intracelulares, es decir, amikacina, cefepima, ceftazidima y meropenem (Fig. 4e). En todas las combinaciones con P[5]a, los valores de concentración mínima inhibitoria (CMI) para los aislados clínicos se redujeron en comparación con el tratamiento con antibióticos solo. Las reducciones más fuertes no fueron específicas de una cepa aislada clínica o tipo de antibiótico, lo que indica que la interferencia de la membrana mejora la penetración de todos los antibióticos con objetivos intracelulares. Esta observación está en línea con otros sensibilizadores de OM34,38.

Luego estudiamos la acumulación de resistencia en PAO1 a la terapia con antibióticos durante un período de 14 días. Mientras que en las terapias con antibióticos independientes de aztreonam, cefepima, meropenem y tobramicina (Fig. 4f-i), en todas las administraciones encontraron resistencia, en la administración combinada, ningún antibiótico encontró resistencia. Aztreonam, cefepima y tobramicina permanecieron totalmente susceptibles, mientras que meropenem alcanzó una sensibilidad intermedia. El tiempo promedio para que los niveles de resistencia se duplicaran aumentó considerablemente (Fig. 4j). En conjunto, estos resultados enfatizan el potencial de P [5] a para revitalizar las terapias con antibióticos disponibles y reducir los encuentros resistentes (Fig. 4k).

Los aislados de infecciones agudas a menudo producen niveles elevados de endotoxinas, proteasas, sideróforos y demuestran una mayor motilidad39. Por el contrario, los aislados de infecciones crónicas a menudo priorizan un fenotipo mucoide, tiempos de duplicación reducidos y mayores niveles de producción de biopelículas. A esta variación se suma una plétora de mecanismos de resistencia cada vez más prevalentes. En conjunto, estos rasgos han aumentado significativamente el umbral para nuevos tratamientos40. En consecuencia, probamos la efectividad de P[5]a contra un gran subconjunto de 72 aislados de P. aeruginosa, que consiste en una colección de serotipos del Esquema Antigénico Internacional (IATS) (19 aislados), una colección crónica de FQ (20 aislados) y un conjunto de aislados clínicos resistentes a múltiples fármacos (MDR) con diversos perfiles de resistencia a los antibióticos (33 aislados) (Fig. 5a, Datos complementarios 1). P[5]a mostró una actividad generalizada, reduciendo los niveles de biopelículas en más del 96%, con una significancia superior al 92%. Sin embargo, en un aislado, la producción de biopelículas aumentó significativamente. No observamos diferencias en los efectos de P[5]a en diferentes colecciones de P. aeruginosa, fenotipo bacteriano, perfil de resistencia a antibióticos o sitio de aislamiento. Es de destacar que P[5]a también demostró ser eficaz contra los mutantes ΔLasR (+), que han perdido la capacidad de detectar la HSL 3-oxo-C12, que es particularmente prevalente en cepas de P. aeruginosa aisladas de infecciones crónicas por FQ41. La clasificación de los perfiles de antibióticos resistentes documentados (Tabla 1 complementaria) frente a la función de P [5] a (Fig. 5b) muestra que P [5] a sigue siendo eficaz contra la mayoría de los mecanismos de resistencia a los antibióticos y los evade.

a Efecto de P[5]a sobre la inhibición de biopelículas después de la formación de un cultivo estático de 24 h en un panel de aislados de P. aeruginosa, que consiste en serotipos IATS de P. aeruginosa, un conjunto de aislados de pacientes con fibrosis quística que padecen infecciones crónicas y un conjunto de aislados clínicos MDR, derivados de diversos sitios de infección. (+) Aislamientos con brillo metálico e iridiscente en la superficie de la colonia, típico de un mutante ΔlasR. Los datos representan valores promedio de réplicas biológicas ± sd (n = 3 por grupo). b Efecto de P[5]a sobre la inhibición de biopelículas en aislados clínicos marcados y resistentes del panel visto en (a). P[5]a inhibió con éxito las biopelículas en aislados resistentes, independientemente del tipo o mecanismo de acción del antibiótico. Los colores de los antibióticos corresponden a la clase de antibióticos. Sólo se incluyeron los aislados marcados como resistentes al tratamiento con antibióticos. El número de aislados resistentes por tipo de antibiótico varía desde Piperacilina-tazobactam hasta Ciprofloxacino 7, 12, 35, 15, 13, 9, 35, 8, 9, 12, 12 y 11 respectivamente. Los diagramas de caja muestran la mediana (línea central), los cuantiles superior e inferior (caja) y el rango de los datos (bigotes). c) Efecto de P[5]a sobre la supresión de la toxina piocianina durante un período de 14 días. P[5]a suprimió con éxito los niveles de toxina durante los 14 días, sin ninguna disminución observable en la eficacia. La expansión resalta los efectos de P [5] a sobre la supresión de toxinas de aislados de MIC50 recultivados de experimentos de desarrollo independientes resistentes a cefepima (izquierda) y meropenem (derecha) (Fig. 4g, h respectivamente). A medida que se desarrolla rápidamente la tolerancia y, posteriormente, la resistencia a estos antibióticos, el P[5]a sigue siendo eficaz para suprimir las toxinas. d P[5]a altera las biopelículas formadas por aislados clínicos altamente resistentes de P. aeruginosa in vitro; Masa media de biopelícula restante después de 16 h de tratamiento con P[5]a. Los datos representan valores promedio de réplicas biológicas ± sd (n = 4 por grupo). Prueba t pareada de dos colas **P < 0,01 *P < 0,05. e Las imágenes de microscopía de fluorescencia de biopelículas formadas por aislamientos de P. aeruginosa demuestran la erradicación de las biopelículas formadas por P [5] a después de 16 h de tratamiento. Las imágenes representan tres experimentos independientes. Barra de escala, 200 µm.

Dada la actividad generalizada contra los aislados clínicos y el desarrollo reducido de resistencia contra los antibióticos en administraciones combinadas, a continuación probamos el desarrollo de resistencia in vitro (Fig. 5c). PAO1 se pasó repetidamente en presencia de P[5]a, donde los niveles de piocianina permanecieron suprimidos durante los 14 días del estudio. A continuación, volvimos a tratar todos los cultivos de MIC50 de PAO1 que se pasaron repetidamente con los antibióticos cefepima y meropenem (Fig. 4g, h, respectivamente). Incluso cuando PAO1 desarrolló una rápida tolerancia y resistencia a los antibióticos, P [5] a siguió siendo completamente efectivo (cefepima, zoom a la izquierda y meropenem, zoom a la derecha en la Fig. 5c). Esfuerzos recientes han descubierto que la tolerancia a los antibióticos precede al desarrollo de resistencia a los antibióticos42,43. Ni los mecanismos de tolerancia ni de resistencia a los antibióticos afectaron la función de P[5]a in vitro, lo que respalda el potencial de estrategias no bactericidas y/o bacteriostáticas dirigidas a la virulencia con una presión selectiva reducida6,7,25.

Al igual que la MO, la biopelícula generalmente tiene carga negativa y surge principalmente de LPS y sustancias poliméricas extracelulares44,45. Evaluamos si P [5] a también podría alterar las biopelículas existentes al exponer cuatro biopelículas de P. aeruginosa altamente resistentes a P [5] a durante 16 h después de un período de formación de 24 h (Fig. 5d, e). Se observó una erradicación significativa de la biopelícula en todos los casos excepto en el aislado 5550 de P. aeruginosa. En el aislado 5842 de P. aeruginosa, la masa de la biopelícula se redujo en más del 75%.

Las membranas biológicas tienen similitudes sorprendentes, con glicerofosfolípidos presentes en ambas membranas bicapa de eucariotas, así como en la valva interna de la OM bacteriana, y LPS presente en la valva externa de la OM. Observamos interacciones entre P [5] a y el OM, lo que resultó en la permeabilización del OM. Entonces, a continuación recurrimos a las células epiteliales A549 con una membrana bicapa que consta de glicerofosfolípidos, principales células efectoras que constituyen barreras físicas contra los patógenos. Determinamos los efectos de P [5] a sobre la viabilidad de las células epiteliales A549 mediante tinción con azul tripán, mostrando baja toxicidad hacia las células A549 y sin actividad lítica de membrana observable (Fig. 6a). Esto sugiere además que las interacciones con la OM bacteriana ocurren a través de interacciones en la valva externa de la membrana, donde se inserta el LPS, en lugar de impactar la valva interna que consiste en glicerofosfolípidos.

una evaluación de la viabilidad del azul tripán de células pulmonares epiteliales A549 tratadas con concentraciones variables de P[5]a. Los datos representan valores promedio de réplicas biológicas. Media (± SEM) (n = 3 por grupo). b Las células epiteliales A549 expuestas a PAO1 durante 16 h muestran apoptosis. P[5]a recupera la apoptosis inducida por PAO1 de manera dependiente de la concentración. Los datos representan valores promedio de réplicas biológicas ± sd (n = 3 por grupo). c Imágenes de microscopía fluorescente de células epiteliales A549 como se ve en (b), ya sea sin tratar, tratadas con P[5]a o expuestas a PAO1 durante 16 h. Se observa una recuperación de la muerte celular dependiente de la concentración cuando se trata con P[5]a. Barra de escala, 50 µm. d Los valores de expresión normalizados obtenidos de la secuenciación de ARNm muestran que la adición de 0,1 mM y 2,5 mM es bien tolerada sin cambios significativos en la regulación genética. Las células A549 desafiadas por el patógeno bacteriano PAO1 muestran una fuerte activación del estrés celular, respuestas inflamatorias y de muerte celular. La adición del tratamiento P[5]a a las células A549 expuestas da como resultado una reducción dependiente de la concentración en el estrés celular, las respuestas inflamatorias y de muerte celular, y también aumenta las respuestas defensivas contra las bacterias (n = 3); Valor p de la prueba de Wald de dos colas, 0,01. El diagrama VENN de la red reguladora de genes se superpone afectados por la infección y el tratamiento. f Cambios en la expresión de Log2FC relacionados con conjuntos de genes del proceso biológico GO expresados ​​diferencialmente; I, II, II corresponde a los diagramas de (e); Valor p ajustado de BH de dos colas.

A continuación, comprobamos si P[5]a podría proteger las células epiteliales contra todo el arsenal de virulencia de un patógeno clínicamente relevante. P [5] a protegió las células A549 contra la apoptosis por PAO1 de una manera dependiente de la dosis, con protección total en concentraciones superiores a 1 mM (Fig. 6b, c). La dependencia de la dosis de P[5]a requerida para lograr una protección completa en A549 contra PAO1 fue comparable a las cantidades requeridas para inhibir los factores de virulencia (piocianina, 3-oxo-C12, LPS, biopelícula), lo que sugiere que estos factores de virulencia son los agentes citotóxicos clave utilizados por el patógeno durante la infección.

Para comprender mejor los efectos protectores de P [5] a durante la infección bacteriana, analizamos el ARNm total de las células epiteliales A549 (Fig. 6d). P[5]a solo tuvo efectos mínimos sobre las células epiteliales A549, y ninguno de los genes expresados ​​diferencialmente se vio alterado en más de log2FC ± 1,2. Además, no observamos respuestas que indiquen cambios en la estabilidad de la membrana bicapa. La adición de PAO1 a las células A549 alteró en gran medida los niveles de expresión, y el enriquecimiento del conjunto de genes (Procesos biológicos GO) mostró cambios importantes en la respuesta inflamatoria, la respuesta a moléculas de origen bacteriano, la quimiotaxis, la muerte celular y la regulación de la proliferación celular (Fig. 6e, f). ). El mayor aumento se observó en los ligandos de quimiocinas (CCL20, CXCL1, CXCL2 y CXCL3) junto con el receptor de superficie (ICAM1), que desempeñan funciones clave en las respuestas inmunitarias e inflamatorias28. La adición de P[5]a a las células epiteliales A549 infectadas provoca una reducción dependiente de la concentración en la respuesta inflamatoria, la quimiotaxis, la muerte celular, la respuesta a moléculas de origen bacteriano y la regulación de los conjuntos de genes de proliferación celular. La reducción más significativa de la expresión dependiente de la dosis se observó en las quimiocinas CCL20, CXCL1, CXCL8 e ICAM1. Observamos una mayor expresión de adrenomedulina (ADM) y factor estimulante de colonias 2 (CSF2), ambos implicados en la respuesta defensiva a la infección bacteriana46,47, lo que indica que la reducción del estrés y las respuestas inflamatorias aumentan las capacidades de eliminación bacteriana.

Reconociendo el importante papel que desempeñan los factores de virulencia durante el establecimiento y la propagación de infecciones bacterianas en sus huéspedes eucariotas, investigamos más a fondo las interacciones directas entre P[5]a y 3-oxo-C12 y LPS purificados, y los efectos posteriores sobre las células epiteliales A549. viabilidad celular. En las bacterias, el 3-oxo-C12 HSL se difunde libremente a través de las membranas bacterianas donde se utiliza como molécula de señalización. Sin embargo, en las células de mamíferos, el 3-oxo-C12 HSL interactúa con las membranas bicapa y produce la alteración de los dominios lipídicos. Esto da como resultado la liberación de citocinas proinflamatorias, TNFR1 que señala la muerte de las células linfocitarias y una exacerbación de la inflamación de las vías respiratorias48. De manera similar, el LPS es un patrón molecular bien conocido asociado a patógenos cuya región del lípido A es reconocida por el receptor tipo peaje TLR4, lo que resulta en la liberación de citocinas inflamatorias, respuestas de muerte celular, aumento de la permeabilidad de la barrera de las vías respiratorias e inflamación pulmonar. Las células A549 que fueron tratadas con 3-oxo-C12 o LPS purificado mostraron un aumento observable de la muerte celular en el primer momento de 2 h, aumentando constantemente con el tiempo. La adición de P[5]a evitó la muerte de las células epiteliales, tanto con 3-oxo-C12 como con LPS, protegiendo las células A549 durante un período de 24 h (Fig. 7a, b). Estos resultados muestran que i) la interacción afecta rápidamente la capacidad del 3-oxo-C12 y el LPS para alterar los dominios de la bicapa lipídica, ii) la interacción es estable en el tiempo (durante un período de 24 h) y iii) los complejos formados no se disocian.

a La adición de P[5]a secuestra el 3-oxo-C12 HSL, protegiendo las células epiteliales A549 contra la apoptosis durante un período de 24 h. Los datos representan valores promedio de réplicas biológicas ± sd (n = 4 por grupo). Prueba t pareada de dos colas ***P < 0,001; **P < 0,01; *P<0,05. b La adición de P[5]a protege las células epiteliales A549 contra la apoptosis inducida por LPS durante un período de 24 h (Pa serotipo 10, 20 µg/ml). Los datos representan valores promedio de réplicas biológicas ± sd (n = 4 por grupo). Prueba t pareada de dos colas ***P < 0,001; **P < 0,01; *P<0,05. c) Diseño del estudio de secuestro de endotoxinas LPS. P[5]a se administra por vía intratraqueal una hora antes de la adición del agente desafiante, LPS (Pa serotipo 10, 10 µg/kg). El líquido BALF se recolecta después de 4 y 24 h y se cuantifica la cantidad de leucocitos y neutrófilos en BALF, junto con las citocinas inflamatorias. d) Efectos de P[5]a, dosificado, sobre los recuentos totales de leucocitos estimulados por LPS en BALF. e Efectos de P[5]a, dosificado, sobre los recuentos totales de neutrófilos estimulados por LPS en BALF. fi Efectos de P[5]a, dosificado, en los recuentos de (f) TNF-α, (g) IL-&, (h) CXCL1 (KC) y (i) CXCL2 (MIP-2) estimulados por LPS en BALF . Un animal (3 mg/kg, 4 h) murió inmediatamente después del tratamiento. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett para comparación múltiple y la prueba de Grubb para excluir valores atípicos. Todos los grupos frente al grupo tratado con veh/LPS, *p < 0,05, **p < 0,01, media (± SEM) (n = 10 animales por grupo).

A continuación, investigamos si P[5]a protege contra la inflamación pulmonar en ratones hembra C57BL/6 J expuestos a LPS. La administración intranasal de LPS, detectada por el receptor TRL4, provoca la inducción de una fuerte respuesta inflamatoria que se caracteriza por la infiltración de neutrófilos y glóbulos blancos en la matriz extracelular y por la liberación de citoquinas que desempeñan un papel fundamental en la salud pulmonar. daño tisular (Fig. 7c). Se administraron por vía intratraqueal (it) tres concentraciones crecientes de P[5]a (0,1, 0,5 y 3 mg/kg). A las 24 h, 3 mg / kg de P [5] a dieron como resultado una reducción total del 30% de los glóbulos blancos (WBC) estimulados por LPS y los neutrófilos en el líquido broncoalveolar (BALF), aunque no fue estadísticamente significativo (Fig. 7d, e, respectivamente). A las 4 h y a dosis de 0,1 y 0,5 mg/kg de P[5]a, no se observaron diferencias observables. A continuación, observamos la liberación de citocinas inflamatorias en respuesta a la estimulación con LPS. A las 4 h, aparte de la IL-6, no se observaron diferencias significativas en los niveles de citocinas entre los grupos estimulados con LPS y tratados con P[5]a (Figura 11 complementaria). Sin embargo, a las 24 h, se observaron reducciones significativas en los niveles de citoquinas tras el tratamiento con P[5]a. Es importante destacar que los niveles de TNF-ɑ, una citocina proinflamatoria característica responsable de la regulación de las células inmunitarias y la apoptosis celular, se redujeron significativamente incluso con la dosis más baja de 0,1 mg/kg (Fig. 7f, Fig. Suplementaria 12, 13). Además, la citocina IL-6 y las quimiocinas CXCL1 y CXCL2, quimioatrayentes clave para macrófagos y neutrófilos, mostraron reducciones estadísticamente significativas con la dosis más baja de 0,1 mg/kg (Fig. 7g, h, i). En general, estos resultados muestran que P[5]a no sólo previno el daño de las células epiteliales, la muerte celular y el aumento de las respuestas defensivas, sino que también redujo la activación inflamatoria inducida por su virulencia. Esto último es de gran importancia in vivo, porque las respuestas inflamatorias incontroladas conducen a exacerbaciones pulmonares y daño tisular extenso49.

La terapia con antibióticos es la base del tratamiento contra la infección bacteriana. Sin embargo, su uso a gran escala combinado con un espectro limitado de objetivos bacterianos ha provocado encuentros de resistencia, ejerciendo presión tanto sobre las terapias existentes como sobre los proyectos de desarrollo.

En este documento, utilizamos una pantalla antivirulencia de macrociclos que interactúan entre huésped e huésped e identificamos un pilarareno sintético soluble en agua, P[5]a (Figura complementaria 14-17), que no es bactericida/bacteriostático. Presenta un mecanismo de acción que implica la unión a HSL (cavidad interna) y LPS (borde catiónico), factores de virulencia clave en patógenos gramnegativos.

Demostramos que P[5]a se une eficazmente a HSL con diferentes longitudes de cadena con constantes de unión en los rangos micromolares. Observamos una unión mejorada a medida que aumenta la longitud de la cadena alquílica huésped de HSL, lo que sugiere que las interacciones hidrofóbicas contribuyen al proceso de reconocimiento. Esta opinión está respaldada cuantitativa y cualitativamente por la RMN, el desplazamiento de colorantes y el modelado de mapas hidrófobos/hidrófilos, que muestran que las cadenas alquílicas hidrófobas más largas se colocan profundamente en la cavidad aromática de P[5]a. La adición de NaCl no tuvo una gran influencia en las constantes de unión de las HSL (independientes de la longitud de las cadenas alquílicas), lo que sugiere que las interacciones electrostáticas no contribuyen al proceso de reconocimiento ni a la estabilidad de la unión. La unión de las HSL dio como resultado la inhibición de las respuestas de virulencia asociadas a QS, incluidas toxinas, motilidad y biopelículas. Combinados, estos resultados sugieren que P[5]a podría funcionar como una estrategia antivirulencia eficaz, particularmente en patógenos que utilizan HSL con largas cadenas de acilo hidrofóbicas.

Por otro lado, observamos que las interacciones electrostáticas desempeñan un papel clave en la unión de P[5]a a LPS en la OM, una barrera altamente impermeable a tratamientos con antibióticos que de otro modo serían efectivos. El LPS en la OM está organizado y estabilizado por cationes divalentes que forman puentes electrostáticos entre el dominio del Lípido A4, principalmente Ca2+ y Mg2+. Nuestra hipótesis es que la unión de P[5]a está mediada por los residuos cargados positivamente en el borde funcionalizado de P[5]a, que interactúan con el resto aniónico del lípido A. Observamos que la interacción con LPS da como resultado la alteración de la organización de la OM, facilitando el acceso y la potencia de los antibióticos estándar a sus objetivos intracelulares, independientemente de su MoA (Fig. 4e). También mostramos que esta sinergia podría explotarse para reducir el desarrollo de resistencia in vitro y potencialmente revitalizar la terapia con antibióticos (Fig. 4e-i). Con el respaldo de informes anteriores sobre macrociclos catiónicos12,21 y la razón de que el LPS es un componente importante de las biopelículas bacterianas45, investigamos la erradicación de las biopelículas formadas por P[5]a. Sin embargo, dada la complejidad de la composición de las biopelículas bacterianas, se requieren esfuerzos futuros para comprender en profundidad las interacciones que rigen la erradicación.

El LPS también es el objetivo del antibiótico polimixina B (PMB). Las polimixinas desplazan competitivamente los cationes de los dominios del lípido A, lo que resulta en la desestabilización de la OM. Sin embargo, cuando PMB también induce la despolarización o desestabilización de la membrana citoplasmática, las evaluaciones de viabilidad bacteriana (Fig. 1f) mostraron que P [5] a no tuvo ningún efecto observable en la membrana citoplasmática. Especulamos que los efectos de P[5]a en la membrana bacteriana podrían ser más comparables a los de SPR74134 y los antibióticos dirigidos a OM (OMPTA)50,51,52. Estas moléculas conservan la capacidad de alterar la valva externa de la OM bacteriana, donde se inserta el LPS, pero carecen de la capacidad de interactuar con la valva interna de la OM bacteriana que consiste en glicerofosfolípidos y las membranas citoplasmáticas. Esto se ve respaldado aún más por la ausencia de efectos líticos de P [5] a en las membranas de bicapa lipídica de eucariotas, que también están compuestas de glicerofosfolípidos (Fig. 5a-e, Fig. 11 complementaria).

La validación contra aislados clínicos MDR muestra que P[5]a permanece activo contra patógenos con una amplia variedad de mecanismos de resistencia a antibióticos, incluidos A. baumannii y P. aeruginosa de máxima prioridad resistentes a carbapenémicos. Además, P[5]a no tiene efectos bactericidas/bacteriostáticos, lo que hace poco probable el desarrollo de resistencia rápida53. Esto se ve respaldado por la supresión eficaz de toxinas durante un período de 14 días. Además, a medida que se desarrolló tolerancia y posteriormente resistencia a los antibióticos cefepima y meropenem durante un tratamiento de 14 días, en cada momento, estos aislados permanecieron completamente susceptibles a P[5]a. En conjunto, estos resultados resaltan el impacto potencial que diferentes objetivos y estrategias bacterianas pueden tener sobre los antibióticos estándar, evadiendo los mecanismos de resistencia a los antibióticos y evitando los mecanismos de acumulación de resistencia bacteriana; potencialmente sorteando algunos de los principales obstáculos que enfrenta actualmente el desarrollo de antiinfecciosos. Una pregunta clave que permanece es si los aislados clínicos con resistencia a la colistina y PMB, de los cuales las modificaciones del lípido A con 4-aminoarabinosa y fosfoetanolamina son los principales mecanismos de resistencia, afectan la actividad de P[5]a54. Curiosamente, sin embargo, P [5] a permaneció activo contra los aislados de ΔLasR, que carecen del receptor HSL 3-oxo-C12 (Fig. 5a). Esto sugiere que la polifarmacología del compuesto podría ser una estrategia potente para superar la resistencia parcial. Como tal, en este trabajo se ha explotado el mecanismo de acción dual de P[5]a previamente informado18 para atacar tanto el 3-oxo-C12 HSL (cavidad interna, interacción hidrofóbica) como el LPS (borde policatiónico externo, interacciones electrostáticas). y proporciona un enfoque prometedor para abordar la resistencia bacteriana.

Observamos que la unión de P[5]a tanto a 3-oxo-C12 como a LPS da como resultado el secuestro de acción directa de sus propiedades tóxicas, tanto in vitro como in vivo. En conjunto, las toxinas alteran las barreras tisulares, impiden las defensas inmunitarias del huésped contra los patógenos y ayudan a promover el crecimiento y la colonización bacteriana y aumentan las posibilidades de una infección exitosa7. Las células A549 expuestas a 3-oxo-C12 y LPS quedaron completamente protegidas tras la adición de P [5] a (Fig. 5a, b). La unión de LPS también respalda aún más la interacción específica de P[5]a con el resto del lípido A, ya que específicamente el receptor TLR4 reconoce la región del lípido A, lo que da como resultado la liberación de citoquinas y respuestas de muerte celular. Además, la adición de P[5]a a células A549 expuestas a PAO1 mostró una recuperación de la muerte celular dependiente de la dosis, lo que indica que las toxinas y otros factores de virulencia desempeñan un papel central en las respuestas de muerte celular y la propagación de infecciones, lo cual es consistente con observaciones anteriores (Fig. 5c – g) 6,7.

Nuestros datos proporcionan un argumento convincente para buscar inhibidores de virulencia basados ​​en macrociclos como paradigma para el tratamiento de infecciones bacterianas. Su doble funcionalidad de inhibir la virulencia a través del secuestro de HSL en su cavidad interna, junto con los efectos potenciadores de la OM que sensibilizan a los patógenos a los antibióticos, respalda el uso de P[5]a como tratamiento independiente y combinado con antiinfecciosos existentes. Nuestros hallazgos también presentan una perspectiva prometedora sobre el uso de la química huésped-huésped de diseño racional hacia la síntesis de moléculas de acción dual que pueden usarse en el tratamiento de patógenos bacterianos resistentes a los antibióticos.

Nuestra investigación cumple con todas las normas éticas pertinentes; Decreto Legislativo Italiano N° 26/2014 y Directiva Europea N° 2010/63/UE. El estudio se realizó de acuerdo con la legislación nacional, bajo la aprobación del Comité interno de Aptuit sobre Ética e Investigación Animal y bajo la autorización emitida por el Ministerio de Salud italiano (Proyecto de autorización del Ministerio de Salud italiano - Código interno No. 30004-B64).

En la Tabla complementaria 1 se incluye una tabla completa de líneas celulares, cepas bacterianas y plásmidos utilizados en este estudio. La cepa Top10 de E. coli se utilizó para la clonación y la construcción del plásmido, mientras que la cepa CY008 (BW25113 ΔlacI ΔaraC ΔsdiA; laboratorio Bennett, Universidad Rice , Texas, EE. UU.) se utilizó para todas las mediciones de fluorescencia.

Los cultivos individuales se cultivaron durante la noche en caldo Luria (LB) con antibióticos apropiados (ampicilina, 100 μg ml-1 y kanamicina, 50 μg ml-1) a 37 °C.

Los aislados clínicos de P. aeruginosa y A. baumannii se obtuvieron de varias fuentes: el panel de aislados clínicos de FQ se obtuvo del Dr. A. Bragonzi, líder de grupo de la Unidad de Infecciones y Fibrosis Quística del Instituto San Raffaele.

Los aislados clínicos de P. aeruginosa y A. baumannii se obtuvieron de la colección del Hospital Universitario de Helsinki (HUS) o fueron aislados de pacientes por el médico jefe Dr. A. Pätäri-Sampo. La recogida de los aislados cumplió plenamente con la Ley sobre el estatuto y los derechos de los pacientes” (785/1992). Como tal, la información recopilada sobre los aspectos clínicos de los aislados de SUH fue limitada y de ninguna manera rastreable a pacientes individuales y la información documentada se limitó al serotipo bacteriano, el sitio de aislamiento y el perfil de resistencia a los antibióticos.

Las “superbacterias de prioridad global” se obtuvieron de la colección de la ATCC de cepas clínicamente relevantes y resistentes a los medicamentos con metadatos de origen y caracterización genotípica y fenotípica.

Se trataron células de carcinoma de pulmón humano A549 con TrypLE (Thermo Fisher Scientific) antes del inicio del experimento, se dividieron, se contaron y se dividieron en placas de 96 pocillos a razón de 20.000 células de mamífero por pocillo. Los recuentos de células se estimaron utilizando un contador de células TC20 (BioRad). Las células se cultivaron durante 24 h a 37 ° C en DMEM (Gibco) con suero bovino fetal al 10% (Gibco), 1 × PenStep (Sigma) y 1 × GlutaMAX (Gibco). Después del período de crecimiento de 24 h, las células se lavaron con 1x PBS tibio.

Los plásmidos se construyeron como se describió anteriormente55. Brevemente, se clonaron fragmentos en dos cadenas principales de vectores diferentes, pACYC (amp) para las proteínas receptoras y pColE1 (kan) para los promotores AHL, que se fusionaron con las proteínas fluorescentes. Todas las secuencias fueron verificadas mediante secuenciación de ADN. Las proteínas fluorescentes ECFP, EGFP, mKO2 y mCherry se marcaron con la secuencia de la etiqueta de degradación de LAA. Los plásmidos se describen en la Tabla 2 de información complementaria.

Lactonas homoserina (HSL; N-Butiril-L-HSL (C4), N-(ß-Ketocaproil)-DL-HSL ( > 98%) (3-oxo-C6), N-(p-Coumaroil)-L- HSL ( > 94%) (pC), N-(3-Oxoocatnoyl)-L-HSL ( > 97%) (3-Oxo-C8) y N-(3-Oxododecanoil)-L-HSL ( > 98%) (3-oxo-C12) se usó tal como se recibió de Sigma-Aldrich. Se usó N-(3-Hidroxi-7-cis-tetradecanoil)-L-HSL (>95%) (3-OH-C14:1) como recibido de Cayman Chemical. Los disolventes orgánicos se adquirieron de Sigma-Aldrich y VWR. El naranja de metilo se adquirió de Sigma-Aldrich. Los lipopolisacáridos, purificados mediante extracción con fenol de Pseudomonas aeruginosa 10, se adquirieron de Sigma-Aldrich. 12-crown-4, 2 -hidroximetil-12-corona-4, 1-Aza-15-Corona-5, 15-Corona-5, 4-sulfocalix[4]areno, 18-Corona-6, Cucurbit[6]uril hidrato, (2-hidroxipropil )-ɑ-ciclodextrina, ɑ-ciclodextrina, Calix[6]areno, 4-terc-butilcalix[6]areno, Metil-β-ciclodextrina, (2-hidroxipropil)-β-ciclodextrina, β-ciclodextrina, 2-hidroxipropil- La ƴ-ciclodextrina, la ƴ-ciclodextrina y el calix[8]areno se adquirieron de Sigma Aldrich & Merck. El P[5]s se sintetizó de acuerdo con los procedimientos informados con caracterización completa56,57. Brevemente, se convirtió 1,4-bis(2-hidroxietoxi)benceno en 1,4-bis(2-bromoetoxi)benceno en presencia de tetrabromuro de carbono y trifenilfosfina en acetonitrilo. En el siguiente paso, el decabromopilar[5]areno se obtuvo a partir de la reacción de 1,4-bis(2-bromoetoxi)benceno y paraformaldehído en presencia de dietil eterato de trifluoruro de boro en diclorometano en una atmósfera de argón. En el paso final, el decabromopilar[5]areno se somete a reflujo con trimetilamina en etanol, y el P[5]a final se recoge como un precipitado después de lavar con más etanol. El resorcinareno Calix[4] fue sintetizado previamente por nosotros con una caracterización completa en el mismo58.

Se preparó un volumen total de 200 µl para cada muestra y se midió en una placa de 96 pocillos (Corning) a 20 °C. A cada muestra se le restó el blanco y se puso a cero a 570 nm utilizando un lector de placas Cytation 3 (AHDiagnostics) o Hidex Sense (Hidex). Las muestras se prepararon por triplicado y se muestran el promedio y la desviación estándar. P. aeruginosa se cultivó durante la noche en medio LB que contenía 1% de D-glucosa y A. baumannii - en LS-LB (0,5% NaCl, 0,1% triptona, 0,5% extracto de levadura) + 1% D-glucosa durante la noche P. aeruginosa y Los cultivos de A. baumannii se diluyeron 1:100 en una placa transparente de 96 pocillos con 200 μl de medio LB que contenía D-glucosa al 1%. Se añadió una concentración de P[5]a 1 mM a partir de una solución madre 100X o una concentración equivalente de H2O destilada. Los cultivos se incubaron durante 24 h a 37 °C. Luego se eliminó el sobrenadante y los pocillos se lavaron tres veces con PBS 1x estéril, una vez con metanol helado para fijar la biopelícula y se dejaron secar. Se añadió una solución de cristal violeta al 0,1 % (Sigma-Aldrich, > 90 %) para teñir la biopelícula durante 15 minutos, seguido de tres pasos de lavado con H2O destilada para eliminar el tinte no unido. Se añadió EtOH al 96% para solubilizar la biopelícula y se dejó durante 30 minutos con agitación suave. Luego se transfirió la solución a una nueva placa estéril de 96 pocillos y se midió la DO570.

Se preparó un volumen total de 200 µl para cada muestra y se midió en una placa de 96 pocillos (Corning) a 20 °C. A cada muestra se le restó el blanco y se puso a cero a 650 nm utilizando un lector de placas Cytation 3 (AHDiagnostics) o Hidex Sense (Hidex). Las muestras se prepararon por triplicado y se muestran el promedio y la desviación estándar. Las constantes de unión se obtuvieron mediante el software Reactlab Equilibria® (Jplus Consulting), ajustando los espectros promediados de cada muestra entre 390 y 490 nm. Las constantes de disociación se calcularon como la inversa de las constantes de asociación. Las asíntotas de unión completa se simularon mediante el software Reactlab EQSIM2 (Jplus Consulting) con los parámetros obtenidos del ajuste.

Determinación de la constante de unión de MO-P5a (k2): se tituló una concentración constante de MO (2,0 × 10-6 M) con cantidades crecientes de P5a, a 0 y 50 mM de NaCl (Fig. S1a, b). Ambas longitudes de onda de triplicados independientes se ajustaron con éxito a un modelo de unión 1: 1 (Fig. S1c).

Determinación de la constante de unión de P5a-HSL (k1): se tituló una concentración de complejo MO-P5a con cantidades crecientes de HSL. Para asegurar la formación del complejo se utilizaron diferentes condiciones a 0 y 50 mM de NaCl.

NaCl = 0 mM: [MO] = [P5a] = 2,0 × 10−6 M

NaCl = 50 mM: [MO] = 2,0 × 10-6 M; [P5a] = 1,0 × 10−5M

Las muestras se prepararon añadiendo un volumen constante (2 µl) de concentración variable de HSL en DMSO puro a 198 µl de las soluciones mencionadas anteriormente.

Se preparó un volumen total de 200 µl para cada muestra y se midió en una placa de 96 pocillos (Corning) a 20 °C. A cada muestra se le restó el blanco y se puso a cero a 695 nm utilizando un lector de placas Cytation 3 (AHDiagnostics) o Hidex Sense (Hidex). Las muestras se prepararon por cuadruplicado y se muestra el promedio y la desviación estándar. Los cultivos de PAO1 durante la noche se diluyeron 1:100 en 200 µl de medio LB. Se agregaron concentraciones variables de P[5]a a partir de una solución madre 100X o una concentración equivalente de dH2O. Los cultivos se incubaron durante 24 h a 37 °C. El líquido de cultivo se obtuvo mediante centrifugación a 16,3 x 1000 g durante 15 minutos y se pasó a través de filtros accionados por jeringa de 0,22 μm. La solución libre de células se transfirió a una nueva placa estéril de 96 pocillos y se midió la DO695.

En este estudio se desarrolló el sistema indicador fluorescente de 6 cepas de E. coli que detectan 6 HSL diferentes (Fig. 1b) para detectar macrociclos que afectan la señalización bacteriana. Para crear las cepas informadoras, la cepa CY008 de E. coli se transformó con dos plásmidos (Tabla complementaria 2): uno con un gen que codifica una proteína receptora exclusiva de una determinada HSL, bajo un promotor constitutivo, y el segundo tiene un gen para una proteína fluorescente (EGFP, para el sistema informador; y EGFP, mKO2, CFP y mCherry para comunidades microbianas combinadas) bajo un promotor inducible específico para cierto HSL. La HSL agregada externamente se une a la proteína receptora provocando su dimerización. Tras la dimerización, la proteína receptora se une al promotor y activa la expresión del gen de la proteína fluorescente.

Para probar la interferencia del macrociclo con las HSL, los cultivos nocturnos de cada cepa de E. coli indicadora se diluyeron 1:1000 y se cultivaron hasta una DO600 de 0,2 a 37o C con agitación de 220 rpm. Luego, los cultivos se transfirieron a la placa de 96 pocillos y se mezclaron con las HSL correspondientes (10-6 M) y 0-2,5 mM de compuesto macrocíclico. Los macrociclos se disolvieron en 1X PBS, a menos que se indique lo contrario (tabla complementaria 1, última columna). Para aquellos macrociclos en los que se requería DMSO para la solubilidad, las concentraciones finales en el ensayo se mantuvieron al 1%. La placa se incubó a 37o C con agitación de 180 rpm. La absorbancia OD600 y el desarrollo de la señal fluorescente se controlaron con el lector de placas Cytation 3 (BioTek). Cuanto más fuerte es la unión entre el macrociclo y HSL, menos molécula de señalización libre está presente que puede activar la expresión de fluorescencia en E. coli.

Las interacciones de los macrociclos con las HSL se detectaron mediante la disminución de la relación de las intensidades de fluorescencia a las 6 h con el macrociclo agregado (I1) y sin el macrociclo (I0).

Las cepas de E. coli que producen EGFP, mKO2, CFP y mCherry en respuesta a HSL se analizaron a un caudal bajo en un sistema FACSTMAria III (BD Biosciences, San José, CA) utilizando 488 nm, 561 nm, 405 nm y 633 láseres nm, correspondientemente. Para cada muestra, se midieron 10.000 eventos. Los datos de los canales CFP/DAPI-A (450-40), GFP/FITC-A (530-30), mKO2/PE-A (582-15) y mCherry/PE-Cy5-A (670-14) fueron Se recopiló como área de pulso y se realizó el procedimiento de compensación para evitar la superposición de la recolección de señales.

Se preparó un volumen total de 200 µl para cada muestra y se midió en cámaras de cubreobjetos de 8 pocillos (Nunc Lab-Tek) a 20 °C. Las muestras se prepararon por triplicado y se muestran el promedio y la desviación estándar. Las biopelículas de los aislados de P. aeruginosa ampliamente resistentes 2978, 5550, 5832 y 5842 se establecieron cultivando durante 24 h en cámaras de vidrio de 8 pocillos (Nunc Lab-Tek) llenas con medio LB que contenía D-glucosa al 1%, comenzando con una noche cultivo diluido 1:100. El medio se eliminó y posteriormente se trató con 45,2 µg de P[5]a o PBS durante 16 h adicionales, como se informó anteriormente59. Luego se lavaron las biopelículas con agua y se añadió FM1-43FX (Invitrogen) para teñir la membrana celular bacteriana. La biopelícula se fijó en paraformaldehído al 16%, glutaraldehído al 2,5% y ácido acético al 4,0% en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) durante la noche a 4 °C. Las biopelículas se visualizaron utilizando un microscopio Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Jena, Alemania). La señal fluorescente verde se obtuvo utilizando luz de excitación a 470 nm, mientras se recogía la luz emitida de 515 a 535 nm.

Se preparó un volumen total de 200 µl para cada muestra y se midió en una placa de tratamiento de cultivo de tejidos de 96 pocillos (Corning). A cada muestra se le restó el blanco y se puso a cero a 600 nm utilizando un contador de células TC20 (BioRad). Las muestras se prepararon por triplicado biológico y se muestra el promedio y la desviación estándar. La mezcla maestra contenía 450 µl de medio DMEM (10 % FBS, 1x PenStrep, 1x Glutamax) y 2,5 mM o 100 µM de P[5]a. Las células se incubaron durante 16 h a 37 °C. Después del experimento, las células adheridas se trataron con TrypLE (Thermo Fisher Scientific) y se mezclaron con células libres del sobrenadante. Las células recolectadas se mezclaron 1:1 con TrypanBlue (BioRad) y se contaron.

Las células A549 se cultivaron como se describió anteriormente. Las muestras se prepararon por triplicado biológico y se muestra el promedio y la desviación estándar. Antes del experimento, las células se trataron con TrypLE (Thermo Fisher Scientific), se dividieron, se contaron y se dividieron en alícuotas en placas de 96 pocillos a razón de 50.000 células de mamífero por pocillo. Las células se cultivaron durante 16 h a 37 ° C en DMEM con los siguientes aditivos: suero bovino fetal al 10% (Gibco), 1 × PenStep (Sigma) y 1 × GlutaMAX (Gibco). Luego, las células se lavaron con PBS a 37 °C y se agregaron 50 µl de "mezcla maestra" a cada pocillo para cada condición. La mezcla maestra contenía 450 µl de medio DMEM sin ningún aditivo, tinte verde CellTox (ensayo de citotoxicidad verde CellTox™, Promega), 2,5 mM o 100 µM de P[5]a. La fluorescencia se leyó con un lector de placas Hidex Sense (Hidex) con una fuente de excitación de 490 nm y un filtro de emisión de 520 nm. Las células se incubaron durante 16 h a 37 °C. Los resultados finales se basaron en la diferencia de fluorescencia entre los puntos de tiempo de medición de 2 h y 5 h. El rango lineal y la sensibilidad del experimento se determinaron utilizando DMSO como agente tóxico.

Las células A549 se cultivaron y prepararon como se describe en "Ensayo de citotoxicidad". Las células se expusieron a i) 10 µM de 3-oxo-C12 HSL purificada, ii) 100 µg de LPS purificado o ii) 50 µl de OD600 = 2 P. aeruginosa. La fluorescencia se leyó con un lector de placas Hidex Sense (Hidex) con una fuente de excitación de 490 nm y un filtro de emisión de 520 nm. Las células se incubaron durante 16 h a 37 °C. Los resultados finales se basaron en la diferencia de fluorescencia entre los puntos de tiempo de medición de 2 h y 5 h. Las imágenes fluorescentes y de contraste de fase se adquirieron utilizando un microscopio Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Jena, Alemania). La señal fluorescente verde se obtuvo utilizando luz de excitación a 470 nm, mientras se recogía la luz emitida de 515 a 535 nm. La señal fluorescente roja se obtuvo utilizando luz de excitación a 590 nm, mientras se recogía la luz emitida de 615 a 675 nm.

Los experimentos de velocidad de sedimentación se llevaron a cabo en una ultracentrífuga analítica Beckman Coulter Optima. Todos los experimentos se realizaron a 20oC utilizando piezas centrales estándar de 2 canales en un rotor An-60 Ti. P[5]a y lipopolisacárido de Pseudomonas aeruginosa 10 (Sigma-Aldrich) se midieron en concentraciones de 75 µM y 0,5 g L-1, respectivamente. La mezcla medida de P[5]a y lipopolisacárido se obtuvo mezclando P[5]a y lipopolisacárido en una proporción de 4:1 (concentración final en la mezcla: 125 uM de P[5]a y 0,5 g L-1 de lipopolisacárido). Se utilizó tampón 0,5 x PBS para todas las muestras. Los experimentos de velocidad de sedimentación se realizaron en modo de absorbancia a longitudes de onda de 260, 290 y 305 nm y a dos velocidades del rotor: 25.000 y 60.000 RPM. El análisis de los datos se realizó mediante el software Sedfit y Ultrascan.

Se preparó un volumen total de 300 µL para cada muestra y se midió en cubetas semimicro de PMMA (Brandtech Scientific) a 20 °C. A cada muestra se le restó el blanco y se puso a cero. El diámetro hidrodinámico (Dh) de los conjuntos se midió utilizando un dispositivo DLS de Malvern Instruments (Serie Zetasizer Nano ZS) con un láser de iones He-Ne de 4 mW a una longitud de onda de 633 nm y un detector de fotodiodo de avalancha en un ángulo de 173°. Las muestras se prepararon por triplicado y se muestran el promedio y la desviación estándar. Se disolvieron 100 mg L-1 de LPS purificado de PA10 (extraído con fenol) en 300 µL de H2O destilada, tampones PBS 0,5x o 1x y se titularon con P[5]a (0,1–17,5 mg L-1) para lograr el resultado deseado. relación. Debido a que la adición de volumen no superó el 5 % del volumen total de la muestra, no se incluyeron correcciones de dilución. Para la valoración de complejos LPS-P[5]a (40 µM P[5]a), se utilizó una solución de NaCl de 0,01 a 0,5 M para desmontar los complejos formados.

El ARN de las células A549 y P. aeruginosa PAO1 se extrajo usando un RNeasy Mini Kit (Qiagen), se preparó y se secuenció usando un método diseñado basado en el protocolo Drop-seq60 y descrito con más detalle en (Métodos complementarios Secuenciación). La alineación de lectura y el análisis de datos de RNA-seq se describen con más detalle en (Métodos complementarios Alineación de lectura y análisis de datos de RNA-seq).

Los espectros de 1H RMN se registraron en un espectrómetro Bruker Avance DRX 400. Soluciones madre 5 mM de los receptores (4-Sc[4]a, P[5]a y β-CD), las HSL (C4, pC, 3-Oxo-C6, 3-Oxo-C12 y 3-OH- C14). Se prepararon receptores puros y HSL a una concentración de muestra de 2,5 mM añadiendo 250 µl de solución madre a 250 µl de disolvente puro (D2O o LB). Para mezclas de anfitrión-huésped (receptor-HSL) 1:1, se midieron 250 µl del anfitrión y 250 µl de los invitados para una concentración de 2,5 mM tanto del anfitrión como de los invitados. Los espectros se calibraron utilizando la señal D2O como estándar interno.

Todas las estructuras se calcularon aplicando el conjunto de programas Gaussiano 0961 utilizando el Minnesota M06-2X, un funcional híbrido de correlación de intercambio metaGGA62 junto con el conjunto de bases 6–311 G** de Pople, y el modelo de solvatación continua polarizada de formalismo de ecuación integrada (IEFPCM ) para considerar los efectos de los solventes. Para validar aún más la selección de este conjunto de bases y nivel de teoría para interacciones de largo y corto alcance dentro de los sistemas, todas las optimizaciones se repitieron utilizando el funcional de largo alcance con corrección de dispersión (ωB97X-D)63,64 y el conjuntos de bases combinados; LANL2DZ para Br, y 6–311 G** para el resto de átomos. Se informa que este nivel de teoría es apropiado para modelar los enlaces H y las interacciones huésped-huésped no covalentes dispersivas. Todos los mínimos fueron confirmados por la presencia únicamente de frecuencias vibratorias reales. Las cantidades termoquímicas se evaluaron a 298 K. También se realizaron cálculos de un solo punto en el nivel M062X/6-311 + G** en geometrías optimizadas M062X/6-311 G**. La visualización de la estructura se realizó utilizando GaussView v5.0.8.4 y Maestro 1165. Además, se aplicó la teoría cuántica del átomo en la molécula (QTAIM) para un análisis topológico de las interacciones clave dentro de la cavidad de un huésped y sus características de densidad utilizando Software AIM2000. La distribución de carga se analizó utilizando un mapa de superficie de potencial electrostático molecular (MESP).

Para estudiar la relación entre la estructura y la actividad de diferentes sistemas huésped-huésped, se investigaron el potencial electrostático molecular (MEP) y el desplazamiento MESP, que es la propiedad electrostática más útil. Los cambios de potencial electrostático de la superficie molecular para los complejos huésped-huésped se calcularon como una valiosa herramienta de reconocimiento en el ensamblaje huésped-huésped, en el que se calculó el cubo de densidad de P[5]a, los fragmentos del huésped y los complejos para generar una isosuperficie. Luego asignamos los valores del cambio de ESP dentro del complejo a estas isosuperficies. Los orbitales moleculares (HOMO y LUMO) del complejo debido a la unión de diferentes ligandos (3-OH-C14, 3-Oxo-C12, 3-Oxo-C6) en el bolsillo de unión de P[5]a se calcularon en el Nivel M062X/6-311 G**.

Para evaluar más a fondo las interacciones intermoleculares clave, se aplicó el análisis QTAIM. Se llevó a cabo un análisis topológico de la densidad electrónica con la teoría cuántica de átomos en moléculas de Bader (QTAIM) utilizando el software AIM2000.

Las CIM de cultivos bacterianos activos en presencia de antibióticos y/o P[5]a se determinaron mediante el ensayo de microdilución en caldo Mueller de acuerdo con las directrices del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)37. Los ensayos se realizaron en placas de microtitulación de fondo plano de poliestireno de 96 pocillos (NUNC). Brevemente, se inoculó una sola colonia en 5 ml de medio LB y se cultivó hasta la fase de crecimiento exponencial final en una incubadora con agitación a 37 °C. Posteriormente, los cultivos se diluyeron hasta una DO600 (densidad óptica) de 0,002 (equivalente a 1 x 108 UFC ml-1) en medio LB fresco. Se diluyeron en serie 100 μL de medio LB con diferentes concentraciones de antibióticos, y en P[5]a cuando correspondiera, en una placa estéril de 96 pocillos. Posteriormente, se pipetearon 100 μL de las bacterias diluidas en placas de 96 pocillos. En cada placa, las bacterias cultivadas con la máxima concentración de portador y medio se consideraron como controles positivos y negativos, respectivamente. Luego, las placas de 96 pocillos se incubaron estáticamente durante la noche a 37 °C para permitir el crecimiento bacteriano.

La capacidad de una cepa de laboratorio de P. aeruginosa susceptible para desarrollar resistencia contra P[5]a se evaluó mediante una adaptación de un estudio de resistencia de varios pasos mediante subcultivos diarios repetidos en presencia de P[5]a, realizado durante 14 días. Brevemente, los cultivos de P. aeruginosa O1 se cultivaron durante la noche con P[5]a 1 mM en medio LB, luego la DO de las bacterias se ajustó a una DO600 de 0,002. Las células bacterianas se cultivaron durante 24 h en agitación constante. Posteriormente, el líquido de cultivo se obtuvo mediante centrifugación a 16,3 x 1000 g durante 15 min. Los fluidos de cultivo se pasaron a través de filtros accionados por jeringa de 0,22 µm. La solución libre de células se transfirió a una nueva placa estéril de 96 pocillos y se midió la DO695 utilizando un lector de placas Cytation 3 (AHDiagnostics). Los cultivos se utilizaron para una dilución posterior con P[5]a fresco.

La capacidad de una cepa de laboratorio de P. aeruginosa susceptible para desarrollar resistencia a los antibióticos en presencia o ausencia de P[5]a se evaluó mediante un estudio de resistencia de varios pasos mediante subcultivos diarios repetidos en presencia del valor medio de CIM de la concentración de antibiótico activo. . Esto se llevó a cabo durante un período de 14 días según las directrices del CLSI. Brevemente, se cultivaron cultivos de P. aeruginosa O1 en medio caldo Mueller y luego se ajustó la DO de las bacterias a una DO600 de 0,002. Las células bacterianas fueron tratadas por el agregador a la mitad de la concentración de MIC; Después de un período de incubación de 24 h, las CIM se analizaron mediante un ensayo de microdilución.

Este estudio estuvo sujeto a la legislación del Decreto Legislativo Italiano N° 26/2014 y la Directiva Europea N° 2010/63/UE. El estudio se realizó de acuerdo con la legislación nacional, bajo la aprobación del Comité interno de Aptuit sobre Ética e Investigación Animal y bajo la autorización emitida por el Ministerio de Salud italiano (Proyecto de autorización del Ministerio de Salud italiano - Código interno No. 30004-B64). Los procedimientos generales para el cuidado y alojamiento de animales están de acuerdo con las recomendaciones actuales de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio. El sexo fue considerado en el diseño del estudio. Sólo se seleccionaron ratones hembra para este estudio, ya que los ratones macho muestran mayores fluctuaciones en la temperatura corporal y comportamiento de enfermedad en respuesta a los desafíos inmunológicos de los lipopolisacáridos66. Se utilizaron ratones hembra C57BL/6 J de 8 semanas de edad (Charles River France) para el modelo de inflamación pulmonar inducida por LPS.

Administración intratraqueal de P[5]a

Todos los animales fueron anestesiados (4,0–4,5 % de isoflurano; 2 l/min de O2) y se colocaron en una mesa de dosificación en ángulo colocada dentro de una campana extractora. Los animales fueron colocados boca arriba y suspendidos de un alambre por sus dos dientes superiores. Las lenguas de los animales se sacaron suavemente hacia un lado con unas pinzas. Se insertaron en la tráquea una cánula conectada a un tubo PE 100 y una jeringa Hamilton de 100 µl. Se dosificaron 50 µl de vehículo o P[5]a en los pulmones. Los animales se mantuvieron en posición vertical durante unos segundos antes de regresar a su jaula.

Desafío LPS intranasal

Una hora después de la administración del vehículo o P[5]a, todos los animales fueron anestesiados (4,0–4,5% de isoflurano; 2 l/min O2). Una vez que se alcanzó un nivel adecuado de anestesia, a los animales se les administró LPS (50 µl/ratón) usando una pipeta P100 (Gilson). Los animales se mantuvieron erguidos durante un corto período de tiempo después de la dosificación para permitir la distribución de la sustancia por el tracto respiratorio. Luego, los animales fueron colocados en una jaula de recuperación y, una vez completamente conscientes, fueron devueltos a su jaula de origen.

Colección BALF y recuento de células inflamatorias.

Cuatro o veinticuatro horas después de la exposición, los animales se sacrificaron utilizando una combinación de isoflurano y una inyección intraperitoneal de tiopental sódico (300 mg/kg). Se expuso la tráquea y se insertó una cánula guía conectada a una jeringa. Los pulmones se lavaron tres veces con 0,4 ml de PBS. El BALF recuperado se centrifugó a 800 xg durante 10 min a 4 °C. Los sedimentos se resuspendieron en 200 µl de PBS y las células se contaron usando un contador celular automático (Dasit). El sobrenadante de BALF se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 ° C para el análisis posterior de los niveles de mediador.

Análisis de mediadores inflamatorios en líquido BAL.

La cuantificación de IL-1β, IL-6, VEGF-A, MIP-1α, MIP-2, TNFα, KC, IL-17A y MCP-1 se realizó mediante un inmunoensayo basado en electroquimioluminiscencia (tecnología MSD) según las instrucciones. proporcionado en el kit. Las placas MSD se leyeron utilizando un Meso Sector S 600.

Manejo y análisis de datos.

El efecto de los agentes dosificados por vía it se evaluó contra la inflamación pulmonar (neutrofilia) inducida por LPS a las 4 y 24 h después de la exposición. Los datos obtenidos se presentan como media +/- SEM y se visualizan en gráficos. El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 8 mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnetts.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el texto principal y en su archivo de información complementaria. Los datos también están disponibles del autor correspondiente previa solicitud. La secuenciación de ARN de los datos de células epiteliales A549 generadas en este estudio se ha depositado y está disponible en la base de datos NCBI Gene Expression Omnibus con el código de acceso GEO Submission GSE182853. Los datos de secuenciación de ARN de Pseudomonas aeruginosa generados en este estudio se han depositado y están disponibles en la base de datos NCBI Gene Expression Omnibus con el código de acceso GEO Submission GSE182847. Los datos de estructura optimizados para todos los compuestos generados en este estudio se han depositado como archivos de entrada gaussianos y están disponibles en la base de datos Borealis con el código de acceso VF7T7J [https://doi.org/10.5683/SP3/VF7T7J].

Cassini, A. et al. Muertes atribuibles y años de vida ajustados por discapacidad causados ​​por infecciones con bacterias resistentes a los antibióticos en la UE y el Espacio Económico Europeo en 2015: un análisis de modelos a nivel poblacional. Infección por lanceta. Dis. 19, 56–66 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

O'Neill, J. Resistencia a los antimicrobianos: afrontar una crisis para la salud y la riqueza de las naciones. Rev. Antimicrobiano. Resistir. 20, 1-16 (2016).

CENTROS PARA EL CONTROL Y LA PREVENCIÓN DE ENFERMEDADES. COVID-19: Impacto de Estados Unidos en la resistencia a los antimicrobianos, Informe especial. Atlanta, GA: Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU. (2022).

Clifton, LA y cols. Efecto de la eliminación de cationes divalentes en la estructura de modelos de membrana externa de bacterias gramnegativas. Langmuir 31, 404–412 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tacconelli, E. y col. Descubrimiento, investigación y desarrollo de nuevos antibióticos: la lista de prioridades de la OMS sobre bacterias resistentes a los antibióticos y tuberculosis. Infección por lanceta. Dis. 18, 318–327 (2017).

Artículo PubMed Google Scholar

Czaplewski, L. et al. Alternativas a los antibióticos: una revisión de la cartera de proyectos. Infección por lanceta. Dis. 16, 239–251 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Henry, BD y cols. Los liposomas diseñados secuestran exotoxinas bacterianas y protegen de infecciones invasivas graves en ratones. Nat. Biotecnología. 33, 81–88 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Fowler, SA, Stacy, DM y Blackwell, HE Diseño y síntesis de peptómeros macrocíclicos como imitadores de una señal de detección de quórum de Staphylococcus aureus. Org. Letón. 10, 2329–2332 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ziegler, EW y cols. Encapsulación de β-ciclodextrina de AHL sintéticas: implicaciones en la administración de fármacos y hazañas de extinción del quórum. ChemBioChem 22, 1292–1301 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ng, WL, Perez, L., Cong, J., Semmelhack, MF & Bassler, BL Moléculas sensibles a pro-quórum de amplio espectro como inhibidores de la virulencia en vibrios. Patógeno PLoS. 8, e1002767 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

de la Fuente-Núñez, C., Refuveille, F., Haney, EF, Straus, SK y Hancock, REW Péptido antibiopelícula de amplio espectro que se dirige a una respuesta al estrés celular. Patógeno PLoS. 10, e1004152 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Jennings, MC, Ator, LE, Paniak, TJ, Minbiole, KPC y Wuest, WM Propiedades de erradicación de biopelículas de anfífilos de amonio cuaternario: imitaciones simples de péptidos antimicrobianos. Chembiochem 15, 2211-2215 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yoshizumi, A. y col. Eficacias del EDTA cálcico en combinación con imipenem en un modelo murino de sepsis causada por Escherichia coli con β-lactamasa NDM-1. J. Infectar. Chemadre. 19, 992–995 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Corbett, D. y col. Potenciación de la actividad antibiótica mediante un nuevo péptido catiónico: potencia y espectro de actividad de SPR741. Antimicrobiano. Agentes Chemother. 61, e00200–e00217 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Villar, EA et al. Cómo se unen las proteínas a los macrociclos. Nat. Química. Biol. 10, 723–731 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ogoshi, T., Yamagishi, TA y Nakamoto, Y. Anfitriones macrocíclicos en forma de pilar Pilar[n]arenos: nuevos actores clave para la química supramolecular. Química. Rev. 116, 7937–8002 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kiesilä, A. et al. Formación simultánea de complejos endo y exo de dímeros de piridina[4]areno con huéspedes neutros y aniónicos. Angélica. Química. - En t. Ed. 56, 10942–10946 (2017).

Artículo de Google Scholar

Shaukat, A., Anaya-Plaza, E., Beyeh, NK y Kostiainen, MA Química huésped-huésped orgánica e inorgánica simultánea dentro de estructuras de jaula de proteína-pilarareno. Química. - Un euro. J. 28, e2021043 (2022).

Google Académico

José, R. et al. Los pilararenos catiónicos inhiben potentemente la formación de biopelículas sin afectar el crecimiento ni la viabilidad bacteriana. Mermelada. Química. Soc. 138, 754–757 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yamamura, H. y col. Poli (alquil amino modificado) β-ciclodextrinas antimicrobianas activas en membrana sintetizadas: mediante reacciones de clic. MedChemComm 9, 509–518 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mitchell, MA y cols. El salto de andamios de anfífilos multicatiónicos produce tres nuevas clases de antimicrobianos. ChemBioChem 16, 2299–2303 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bassler, BL Pequeña charla: comunicación entre células en bacterias. Celda 109, 421–424 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Brachmann, AO y cols. Pironas como moléculas de señalización bacteriana. Nat. Química. Biol. 9, 573–581 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Welsh, MA, Eibergen, NR, Moore, JD y Blackwell, HE La alteración de la regulación cruzada de la detección de quórum por moléculas pequeñas en Pseudomonas aeruginosa provoca alteraciones importantes e inesperadas en los fenotipos de virulencia. Mermelada. Química. Soc. 137, 1510-1519 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cámara, M., Williams, P. & Hardman, A. Controlar la infección sintonizando y bajando el volumen de las conversaciones triviales bacterianas. Infección por lanceta. Dis. 2, 667–676 (2002).

Artículo PubMed Google Scholar

Francés, S. et al. Potenciación de antibióticos contra bacterias gramnegativas mediante el análogo de polimixina B SPR741 a partir de una perturbación única de la membrana externa. Infección por SCA. Dis. 6, 1405-1412 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Rutherford, ST y Bassler, BL Sensación de quórum bacteriano: su papel en la virulencia y posibilidades para su control. Puerto de primavera fría. Perspectiva. Medicina. 2, 1–26 (2012).

Artículo de Google Scholar

Rada, B. y Leto, TL Efectos de la piocianina sobre el epitelio respiratorio: relevancia en las infecciones de las vías respiratorias por Pseudomonas aeruginosa. Tendencias Microbiol. 21, 73–81 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bottomley, MJ, Muraglia, E., Bazzo, R. & Carfì, A. Conocimientos moleculares sobre la detección de quórum en el patógeno humano Pseudomonas aeruginosa a partir de la estructura del regulador de virulencia LasR unido a su autoinductor. J. Biol. Química. 282, 13592–13600 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nguyen, BT y Anslyn, ensayos de desplazamiento del indicador EV. Coordinación. Química. Rev. 250, 3118–3127 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Zheng, Z. et al. Guanidinocalix[5]areno para la detección sensible de fluorescencia y la eliminación magnética de contaminantes perfluorados. Nat. Comunitario. 10, 5762 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y., Verma, P., Jin, X., Truhlar, DG & He, X. Densidad funcional M06 revisada para la química de grupos principales y metales de transición. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 115, 10257–10262 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Deligianni, E. et al. Los aislados de fibrosis quística de Pseudomonas aeruginosa de genotipo RAPD similar exhiben diversidad en la capacidad de formación de biopelículas in vitro. BMC Microbiol. 10, 38 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Vaara, M. Derivados de polimixina que sensibilizan a las bacterias gramnegativas a otros antibióticos. Moléculas 24, 249 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, Y.-X., Zhong, Z., Zhang, W.-P. y Qian, P.-Y. Descubrimiento de péptidos catiónicos no ribosómicos como antibióticos gramnegativos mediante la minería global del genoma. Nat. Comunitario. 9, 3273 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kalsin, AM y cols. Autoensamblaje electrostático de cristales de nanopartículas binarias con una red similar a un diamante. Ciencia 312, 420–424 (2006).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Testing, S. Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio: Estándares de desempeño para el Suplemento de pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos M100S. (2016).

Stokes, JM y cols. La pentamidina sensibiliza a los patógenos gramnegativos a los antibióticos y supera la resistencia adquirida a la colistina. Nat. Microbiol. 2, 17028 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Ude, S., Arnold, DL, Moon, CD, Timms-Wilson, T. & Spires, AJ Formación de biopelículas y expresión de celulosa entre diversos aislados ambientales de Pseudomonas. Reinar. Microbiol. 8, 1997-2011 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Burki, T. El proceso de desarrollo de antibióticos se reduce a un mínimo. Infección por lanceta. Dis. 17, 1128-1129 (2017).

Artículo PubMed Google Scholar

Cigana, C. y col. La eficacia de los antibióticos varía según el modelo de infección y el régimen de tratamiento de Pseudomonas aeruginosa. EUR. Respirar. J. 55, 1802456 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Levin-Reisman, I. et al. La tolerancia a los antibióticos facilita la evolución de la resistencia. Ciencia 355, 826–830 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Balaban, NQ y cols. Definiciones y directrices para la investigación sobre la persistencia de antibióticos. Nat. Rev. Microbiol. 17, 441–448 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Novotny, LA, Goodman, SD y Bakaletz, LO Dirigirse a una proteína bacteriana DNABII con un inmunógeno peptídico quimérico o un anticuerpo monoclonal humanizado para prevenir o tratar infecciones recalcitrantes mediadas por biopelículas. EBioMedicina 59, 102867 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mokrzan, EM et al. Los Haemophilus influenzae no tipificables recién liberados (NRel) de biopelículas mediante dispersión mediada por anticuerpos versus alteración mediada por anticuerpos son fenotípicamente distintos. Biopelícula 2, 100039 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Angeletti, S. y col. Papel diagnóstico y pronóstico de la procalcitonina (PCT) y MR-pro-Adrenomedulina (MR-proADM) en infecciones bacterianas. Apmis 123, 740–748 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Stevens, DL ¿Podrían los fármacos antiinflamatorios no esteroides (AINE) mejorar la progresión de las infecciones bacterianas hasta el síndrome de shock tóxico? Clínico. Infectar. Dis. 21, 977–980 (1995).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Canción, D. et al. El metabolito con detección de quórum de Pseudomonas aeruginosa induce la muerte de las células inmunitarias del huésped mediante la disolución del dominio lipídico de la superficie celular. Nat. Microbiol. 4, 97-111 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Heijerman, H. Infección e inflamación en la fibrosis quística: una breve reseña. J. quiste. Fibros. 4, 3–5 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lutero, A. et al. Antibióticos peptidomiméticos quiméricos contra bacterias Gram negativas. Naturaleza 576, 452–458 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Li, J. y col. Colistina: el antibiótico reemergente para las infecciones bacterianas gramnegativas multirresistentes. Infección por lanceta. Dis. 6, 589–601 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Inami, H. y col. Sistema semiautomático de detección de esporas bacterianas con chips de microfluidos para recolección de aerosoles, tratamiento de esporas y detección de ADN ICAN. Biosens. Bioelectrón. 24, 3299–3305 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Imai, Y. et al. Un nuevo antibiótico mata selectivamente los patógenos gramnegativos. Naturaleza 576, 459–464 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Beceiro, A. et al. Modificación con fosfoetanolamina del lípido A en variantes de Acinetobacter baumannii resistentes a colistina mediada por el sistema regulador de dos componentes pmrAB. Antimicrobiano. Agentes Chemother. 55, 3370–3379 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Osmekhina, E. y col. Comunicación controlada entre poblaciones bacterianas físicamente separadas en un dispositivo de microfluidos. Comunitario. Biol. 1, 97 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Montes-García, V. et al. Síntesis de nanopartículas de oro mediada por areno del pilar [5]: capacidades de detección y control de tamaño. Química. – Un euro. J. 20, 8404–8409 (2014).

Artículo de Google Scholar

Ogoshi, T. & Yamagishi, T. Conjuntos supramoleculares basados ​​en arenos de pilar [5] y pilar [6] construidos utilizando sus interacciones huésped-huésped que dependen del tamaño de la cavidad. Química. Comunitario. 50, 4776–4787 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Beyeh, NK y cols. Reconocimiento de derivados viológenos en agua mediante cloruros de resorcinareno de N-alquilamonio. J. Org. Química. 82, 5198–5203 (2017).

Novotny, LA, Jurcisek, JA, Goodman, SD y Bakaletz, LO Los anticuerpos monoclonales contra las puntas de unión al ADN de las proteínas DNABII interrumpen las biopelículas in vitro e inducen la eliminación bacteriana in vivo. EBioMedicine 10, 33–44 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Macosko, EZ et al. Perfiles de expresión altamente paralelos de todo el genoma de células individuales utilizando gotitas de nanolitros. Celda 161, 1202-1214 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Frisch, MJ y cols. Gaussiano 16, Revisión C.01. (2016).

Walker, M., Harvey, AJA, Sen, A. & Dessent, CEH Rendimiento de los funcionales de densidad M06, M06-2X y M06-HF para grupos aniónicos conformacionalmente flexibles: los funcionales M06 funcionan mejor que B3LYP para un sistema modelo con dispersión y Interacciones iónicas entre enlaces de hidrógeno. J. Física. Química. A 117, 12590–12600 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Becke, AD Termoquímica densidad-funcional. III. El papel del intercambio exacto. J. química. Física. 98, 5648–5652 (1993).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Herce-Sesa, B., López-López, JA, Pinto, JJ & Moreno, C. Microextracción con solvente a base de líquido iónico de Ag y Cd de aguas salinas e hipersalinas. Química. Ing. J. 308, 649–655 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Williamson, JR Cooperatividad en ensamblaje macromolecular. Nat. Química. Biol. 4, 458–465 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cai, KC y cols. Diferencias de edad y sexo en la respuesta inmune después del tratamiento con LPS en ratones. Cerebro. Comportamiento. Inmune. 58, 327–337 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

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Los autores desean agradecer la financiación de la Academia de Finlandia a través de su Programa de Centro de Excelencia Materiales híbridos inspirados en la vida (subvención LIBER 346105, 346109, 346110, 2022-2029: CJ, EO, MAK, RHAR, MBL) y Proyectos de la Academia ( subvención 272578: y 272579: CJ, EO, MBL, NKB, RHAR), así como financiación de Research to Business de Business Finland (números de proyecto 6764/31/2019: CJ, EO, MBL y 6768/31/2019: KL, PD). Agradecemos el apoyo de la Universidad de Oakland, MI, EE. UU. También queremos reconocer al Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Naturales de Canadá (subvención 2018-06338: SMT, JFT) y al Tricouncil canadiense (NFRFE-2018-00075: SMT, JFT). SMT y JFT desean reconocer que este trabajo fue posible gracias a las instalaciones de la Red de Computación de Investigación Académica Jerárquica Compartida (SHARCNET: www.sharcnet.ca) y Compute/Calcul Canada. El servicio de secuenciación de RNAseq fue proporcionado por la Unidad de Genómica Funcional de Biomedicum del Instituto de Ciencias de la Vida de Helsinki y el Biocentro de Finlandia de la Universidad de Helsinki. Queremos agradecer al Dr. A. Bragonzi por los aislados clínicos de P. aeruginosa en FQ. También nos gustaría agradecer al Dr. A. Pätäri-Sampo por los aislados clínicos de P. aeruginosa y A. baumannii, del Hospital Universitario de Helsinki (HUS). Nos gustaría agradecer a S. Soidinsalo por las detalladas discusiones y aportes.

Universidad Aalto, Facultad de Ingeniería Química, Departamento de Bioproductos y Biosistemas, Kemistintie 1, 02150, Espoo, Finlandia

Christopher Jonkergouw, Ekaterina Osmekhina, Dmitry Fedorov, Eduardo Anaya-Plaza, Mauri A. Kostiainen, Robin HA Ras y Markus B. Linder

Universidad de Oakland, Departamento de Química, 146 Library Drive, Rochester, MI, 48309-4479, EE. UU.

Ngong Kodiah Beyeh

Universidad Aalto, Facultad de Ciencias, Departamento de Física Aplicada, Puumiehenkuja 2, Espoo, Finlandia

Haga clic en Descargar para guardar Ngong Kodiah Beyeh - Robin Ha Ras mp3 youtube com

Universidad de Helsinki, Programa de Investigación en Inmunología Traslacional, Haartmaninkatu 8, 0014, Helsinki, Finlandia

Katarzyna Leskinen y Päivi Saavalainen

Universidad de Windsor, Departamento de Química y Bioquímica, Windsor, ON, N9B 3P4, Canadá

S. Maryamdokht Taimoory y John F. Trant

Universidad de Michigan, Departamento de Química, Ann Arbor, MI, EE. UU.

S. Maryamdokht Taimoory

Instituto de Genética de Salud Pública, Centro de Investigación en Salud Pública, Helsinki, Finlandia

Päivi Saavalainen

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Conceptualización, CJ, NKB, EO, RHAR y MBL; Metodología, CJ, EAP, NKB, EO, KL, DF, SMT y JFT; Análisis, CJ, NKB, EO, KL, SMT, EAP, MAK, DF, JFT, RHAR, PS y MBL; Redacción, CJ, NKB, JFT, RHAR, KL y MBL; Revisión y edición, JFT, RHAR, PS y MBL

Correspondencia a Christopher Jonkergouw, Päivi Saavalainen o Markus B. Linder.

La Universidad Aalto, junto con la Universidad de Helsinki, ha presentado solicitudes de patente FI20185841A1, FI20205369A1 y FI20205368A1 sobre los efectos de los macrociclos en patógenos gramnegativos, con CJ, NKB, EO, KL, RHAR, PS y MBL como coinventores. CJ, EO y KL son cofundadores de Arivin terapéutica Oy. Los financiadores no tuvieron influencia en el diseño o la recopilación de resultados, la interpretación de los datos o la redacción del manuscrito. Los demás autores no declaran tener otros intereses en conflicto.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Jonkergouw, C., Beyeh, NK, Osmekhina, E. et al. Reutilización de la química huésped-huésped para secuestrar la virulencia y erradicar biopelículas en Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii resistentes a múltiples fármacos. Nat Comuna 14, 2141 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37749-6

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Recibido: 15 de agosto de 2022

Aceptado: 29 de marzo de 2023

Publicado: 14 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37749-6

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