El aumento del sodio intracelular mata selectivamente las células de hepatocarcinoma e induce la reducción del tumor del carcinoma hepatocelular en ratones

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 574 (2023) Citar este artículo

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Los tratamientos farmacológicos para el carcinoma hepatocelular (CHC) avanzado tienen una eficacia parcial. Se observa un aumento del contenido de Na+ y la retención de agua en los cánceres humanos y ofrecen objetivos inexplorados para las terapias contra el cáncer. Los niveles de Na+ se evalúan en tratamientos con el catión antibiótico ionóforo monensina mediante fluorimetría, ICP-MS, 23Na-MRI, relaxometría por RMN, análisis confocal o de lapso de tiempo relacionado con la producción de energía, flujos de agua y muerte celular, empleando células HCC tanto murinas como humanas. líneas, hepatocitos murinos primarios o aloinjertos de HCC en ratones NSG. Los niveles de Na+ de las células y tejidos del CHC son de 8 a 10 veces más altos que los de los hepatocitos y los hígados sanos. La monensina aumenta aún más los niveles de Na+ en las células de CHC y en los aloinjertos de CHC, pero no en los hepatocitos primarios ni en el tejido hepático y extrahepático normal. El aumento de Na+ se asocia con el agotamiento de energía, la carga mitocondrial de Na+ y la inhibición del consumo de O2. El aumento de Na+ provoca una mejora de la vida útil del agua intracelular y la muerte de las células CHC, y una regresión y necrosis de los tumores de aloinjerto, sin afectar la actividad proliferativa ni de los CHC ni de los tejidos sanos. Estas observaciones indican que las células del CHC son, a diferencia de las células sanas, energéticamente incapaces de compensar y sobrevivir a una carga de Na+ inducida farmacológicamente, destacando la homeostasis del Na+ como objetivo farmacológico para la terapia del CHC.

El hepatocarcinoma (CHC) es la cuarta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer1 y se espera que su incidencia aumente en las próximas décadas2. El CHC a menudo se detecta en etapas intermedias y avanzadas y el tratamiento principal en estas fases es una terapia sistémica con inhibidores de la tirosina quinasa2, 3. Este enfoque mejora la supervivencia a corto plazo de los pacientes, pero rara vez asegura una remisión completa y, en ocasiones, puede a su vez inducen efectos secundarios dañinos en los tejidos normales2,3.

La búsqueda de opciones terapéuticas alternativas, como apuntar a características específicas de las células cancerosas, es fundamental. Las características específicas del cáncer son muy pocas; sin embargo, una que es prácticamente común en la mayoría de los cánceres es un gradiente de pH inverso con alcalinización intracelular y acidificación extracelular concomitante4,5. El pH alcalino intracelular depende de una respuesta potenciada al aumento de especies ácidas generadas por la activación de la glucólisis, que es la principal fuente de energía en las células cancerosas incluso en presencia de oxígeno (efecto Warburg). La alcalosis intracelular se debe al aumento de la expresión y activación de proteínas reguladoras del pH, entre las que se encuentran los transportadores dependientes de Na+ que operan favoreciendo un influjo neto de Na+ desde el espacio extracelular hacia el citosol4,5.

En los primeros estudios con hepatocitos primarios de roedores (HP) no cancerosos, investigamos el papel de las concentraciones alteradas de Na+ intracelular ([Na+]i) con la muerte y la resistencia a la muerte. Encontramos que una carga progresiva de Na+ precedió a la muerte de HP inducida por condiciones tóxicas que afectaron la actividad mitocondrial y la producción de energía, y que la prevención de un aumento de Na+ retrasó la aparición de la muerte celular6,7. La alteración irreversible de la homeostasis del Na+ provocó una desregulación de los mecanismos de disminución del volumen hepatocelular y eventualmente provocó la muerte de los HP6,7,8.

Hasta la fecha se desconoce la importancia de las variaciones de [Na+]i en la viabilidad de las células cancerosas y los datos disponibles sobre la homeostasis del Na+ en el cáncer son limitados. Sin embargo, estudios pioneros que emplean microanálisis de rayos X de energía dispersiva han informado de un aumento significativo de Na+ intracelular en células tumorales de roedores en comparación con células primarias no cancerosas9. Más recientemente, el análisis no invasivo de imágenes por resonancia magnética con 23Na (23Na-MRI) de gliomas malignos humanos, tumores de mama y próstata, confirmó una mayor concentración de Na+ en comparación con los tejidos normales circundantes10,11,12,13. Además, los estudios relaxométricos de resonancia magnética nuclear (RMN) de ciclo rápido de campo14,15 y de resonancia magnética16,17,18 mostraron una correlación entre el aumento de la constante de tasa de eflujo de la molécula de agua celular (kio) y la agresividad del cáncer. Como tal, el aumento del [Na+]i y los flujos de agua a través de la membrana celular se han considerado recientemente como nuevos biomarcadores de cáncer valiosos tanto para fines de diagnóstico como de pronóstico10,11,12,13,14,15,16,17. 18. También representan dos objetivos completamente inexplorados para la terapia contra el cáncer.

La monensina es un antibiótico aprobado por la FDA para uso veterinario y se usa ampliamente como un ingrediente alimentario eficaz y seguro con actividad coccidiostática. Además de su uso veterinario, numerosos estudios preclínicos han establecido claramente que Monensin muestra potentes efectos anticancerígenos en tumores extrahepáticos y células tumorales19,20. Se ha demostrado que la monensina induce la apoptosis e inhibe la proliferación in vitro de numerosos tipos de células cancerosas, incluidas aquellas que muestran resistencia a múltiples fármacos19, y reduce notablemente el crecimiento in vivo de tumores extrahepáticos xenogénicos20,21,22,23,24.

Hasta la fecha, nunca se ha investigado la principal propiedad química de la monensina en relación con sus efectos cancerígenos. La monensina es, de hecho, un ionóforo catiónico de poliéter capaz de unirse reversiblemente al Na+ y transportarlo a través de la membrana celular a lo largo del gradiente de concentración19. Así, la monensina puede mover pasivamente Na+ desde el espacio extracelular ([Na+]e ≃ 145 mM) al citoplasma ([Na+]i ≃ 15 mM) induciendo una entrada neta de Na+ en las células19.

Sobre la base de nuestras observaciones previas con HP primarios de roedores y de la evidencia emergente de un mayor nivel de Na+ y presión osmótica en los tejidos cancerosos, en el presente estudio investigamos la hipótesis de que las células cancerosas, debido a una mayor concentración intracelular de Na+, en contraste con las células sanas selectivamente incapaces de compensar y sobrevivir a una carga adicional de Na+ inducida por el tratamiento farmacológico del ionóforo de Na+, la monensina. Para este propósito, evaluamos el nivel de Na+ en células de hepatocarcinoma y aloinjertos de CHC e investigamos su sensibilidad a un influjo forzado de Na+ inducido por el ionóforo de Na+ en comparación con HP primarios sanos y tejidos normales.

Los efectos de la monensina sobre la toxicidad celular y las variaciones intracelulares de Na+ se evaluaron en líneas celulares de hepatocarcinoma (HCC) murino (C1C7) y humano (HepG2), así como en HP primarios de ratón. Los tratamientos se monitorearon en células incubadas en condiciones normóxicas y en tampones de Krebs-Henseleit (Krebs) normales o modificados, como se usó anteriormente para los estudios de perturbación de Na+ y muerte primaria de HP6,7,8. Para aumentar la relevancia fisiológica, los tratamientos también se realizaron en medios de cultivo DMEM normales y modificados a medida en condiciones libres de suero.

La monensina eliminó, de manera dosis dependiente, las células C1C7 y HepG2 mantenidas en medio DMEM durante 20 horas (h) con un efecto máximo observado a una concentración de 10 μM (Fig. 1a-c; Fig. 1 complementaria y videos complementarios 1, 2 y 5). Las células HCC incubadas en tampón de Krebs mostraron una sensibilidad mucho más temprana a la monensina, con efectos evidentes ya en la segunda hora de tratamiento y retrasados ​​por la adición del principal componente energético del medio DMEM, 5 mM de glucosa (Fig. 1e). En consecuencia, un agotamiento progresivo del ATP intracelular precedió al comienzo de la muerte de las células HCC y la pérdida de ATP fue apreciable en las células HCC a partir de los 15 minutos (min) cuando se incubaron en Krebs (Fig. 1f), y desde la cuarta hora cuando se mantuvieron en medio DMEM. (Figura 1d). A diferencia de las células HCC, el tratamiento con monensina de HP incubadas en medio Krebs o DMEM no produjo modificaciones significativas en la viabilidad y el contenido de ATP en comparación con las HP no tratadas (Fig. 1a, b, d – f).

a Análisis dosis dependiente de los efectos citotóxicos de tratamientos de 20 h con Monensina (M) en células C1C7, HepG2 y hepatocitos en DMEM ± Na+. b Efectos de tratamientos de 20 h con monensina (M) 10 μM sobre la viabilidad de células C1C7, HepG2 y hepatocitos en DMEM ± Na+. c Imágenes representativas de vida celular in vivo del aumento de Na+ intracelular (verde: ING) y aparición de muerte celular (violeta: TO-PRO3) de células C1C7 expuestas a monensina 10 μM en DMEM + Na+. Marco temporal 30′: T0 0′-T1 30′-T2 60′- T3 90′ -T4 120′. d Los niveles de ATP (nmol/106 células) de células Hp, C1C7 y HepG2 tras 8 h de tratamientos con monensina (M) 10 μM en DMEM ± Na+ (niveles en T0: Hp = 17,5 ± 2,1; C1C7 = 19,9 ± 1,8; HepG2 18,9 ± 1,9). e Viabilidad de células Hp, C1C7 y HepG2 con tratamiento de 4 h de monensina (M) 10 μM en Krebs ± Na+ más o menos glucosa (glu) 5 mM. f Niveles de ATP intracelular de células Hp, C1C7 y HepG2 con tratamientos de 90 min de monensina (M) 10 μM en Krebs ± Na+ más o menos glucosa (glu) 5 mM. Los resultados se expresan como % de controles (n = 8 experimentos independientes). Los símbolos representan el promedio mientras que las barras representan la desviación estándar. Las líneas verdes representan la presencia de sodio en el medio extracelular. ***P < 0,001 con análisis de varianza O-way (ANOVA) Prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni. C1C7 + M + Na+ y HepG2 + M + Na+ significativamente diferentes de C1C7 + M + Na+ y HepG2 + M + Na+; Hepatocitos +M ± Na+ en todos los paneles; y C1C7 + M + Na+ + glu y HepG2 + M + Na+ + glu en el panel e (excepto la segunda hora) y f.

La incubación de CHC en el tampón de Krebs libre de Na +6,7,8 o en el medio DMEM libre de Na + modificado a medida, evitó la disminución del ATP intracelular así como la aparición de daño celular en células CHC tratadas con monensina (Fig. 1a , b, d – f, figura complementaria 1 y vídeos complementarios 3 y 4). Esto indicó que la toxicidad de la monensina se produjo a través de un mecanismo dependiente de Na+ y específico del cáncer que parecía estar relacionado con la disponibilidad de energía.

Como ocurre con la mayoría de las células transformadas, las células HCC dependen principalmente de la glucólisis aeróbica para producir energía25. Sin embargo, una fosforilación oxidativa mitocondrial funcional (OxPhos) puede actuar como una fuente crítica de ATP, especialmente en condiciones de alto consumo de energía. Los análisis de flujo de la tasa de consumo de O2 (OCR) mitocondrial (Fig. 2a, b) mostraron que una incubación de 4 h con monensina en DMEM disminuyó significativamente el consumo de oxígeno basal y sensible a oligomicina de las células HCC, pero no para las HP (Fig. 2a, b). Por otro lado, la monensina aumentó la actividad glucolítica, evaluada en términos de acidificación extracelular (Fig. 2c) y liberación de ácido láctico (Fig. 2d), tanto en células HCC como en HP. Las células incubadas en ausencia de Na+ extracelular impidieron la reducción de la capacidad respiratoria de las células HCC, así como el aumento de la actividad glucolítica tanto de las células HCC como de los hepatocitos (Fig. 2a-d), lo que indica que un influjo de Na+ mediado por monensina promovió un aumento de la energía glucolítica. producción pero también disminuyó aún más la producción de OxPhos ATP en células HCC.

a Flujos de oxígeno de células C1C7 y hepatocitos (HP) incubados durante 4 h con (M) o sin monensina 10 μM en DMEM ± Na+. antes (T1) y después (T2) de la adición del inhibidor de la ATP sintasa oligomicina (n ≥ 3 experimentos independientes). b El consumo de oxígeno está relacionado con la producción de ATP (T1-T2) de células C1C7 y hepatocitos (HP) incubados durante 4 h con o sin monensina 10 μM en DMEM ± Na+. Los datos se expresan como consumo de oxígeno normalizado al contenido de proteína de la muestra (n ≥ 3 experimentos independientes). c pH extracelular de células C1C7 y HP incubadas durante 4 h con o sin monensina 10 μM en DMEM ± Na+ (n = 8 experimentos independientes). d Liberación de ácido láctico de células C1C7 y HP incubadas durante 4 h con o sin monensina 10 μM en DMEM ± Na+ (n = 8 experimentos independientes). Valores normalizados al contenido de proteína de la muestra (c, d) y expresados ​​como % de los valores de control (d). *P < 0,05, ***P < 0,001 con prueba T no apareada.

La enzima que consume mayor energía es la ubicua bomba de membrana plasmática Na+/K+ ATPasa, que es la principal responsable de la eliminación de Na+ de las células26. El tratamiento con monensina extendido hasta 20 h no afectó la actividad basal de Na + / K + ATPasa, evaluada como la capacidad de descomponer el ATP agregado exógenamente (Fig. 3a), excluyendo así un efecto inhibidor directo de la bomba de ATPasa. La actividad funcional de Na+/K+ ATPasa, evaluada como capacidad de absorción de Rb+17 en el curso del tratamiento con monensina sin ATP añadido exógenamente, destacó una reducción temprana, aunque no significativa, de la absorción de Rb+ (Fig. 3b) que fue paralela al agotamiento de ATP ( Fig. 1f) y ausente en condiciones libres de Na + (Fig. 2 complementaria). Esto posiblemente sugiere que el consumo de ATP para extruir sodio por la misma Na+ /K+ ATPasa, condujo a la disminución del ATP intracelular que hizo que la misma bomba Na+ /K+ ATPasa fuera incapaz de alimentar eficientemente una mayor extrusión de sodio, lo que conduce a una progresiva y carga de sodio citotóxico. Esto es consistente con un papel crítico del bloqueo o la reducción de la extrusión de Na+ por la bomba Na+/K+ ATPasa en la toxicidad de la monensina. En consecuencia, el bloqueo de Na + / K + ATPasa con ouabaína aceleró la aparición de daño inducido por monensina en las células HCC, lo que hizo que los HP primarios fueran sensibles a los efectos tóxicos del ionóforo, pero solo en presencia de Na + extracelular (Fig. 3c).

a Actividad basal Na+/K+ ATPasa en hepatocitos (HP), células C1C7 y HEPG2 expuestas 1 h y 20 h a monensina 10 μM (M) en DMEM ± Na+, evaluada como en nmol fosfato/min/mg de proteína y expresada como % de valores de control (n = 4 experimentos independientes). b Actividad funcional Na+ /K+ ATPasa expresada como % de diferencia de la absorción de Rubidio, con respecto al control, para células C1C7 incubadas en tampón Krebs con Monensina 10 μM (n ≥ 2 experimentos independientes). c Viabilidad celular de células C1C7 y de HP incubadas con monensina (M) 10 μM más o menos ouabaína (ouab) Krebs ± Na+ 1 mM. Los resultados se expresan como % del valor de los controles respectivos (n = 8 experimentos independientes). Los símbolos o barras representan el promedio, mientras que las barras de error representan la desviación estándar. ***P < 0,001 con prueba T no apareada.

Analizamos las variaciones de [Na+]i monitoreando los cambios de la fluorescencia relativa del colorante [Na+]i ION Natrium-Green AM (ING-AM) y cuantificando [Na+]i mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). . El análisis ICP-MS mostró que las HP no tratadas tenían un menor contenido de Na+ (expresado como nmol de Na+ normalizado a mg de proteínas celulares) en comparación con las células HCC de ratón y humanas (Fig. 4a). Esto confirmó el aumento de la concentración de sodio intracelular en las células cancerosas en comparación con las células primarias observadas mediante microanálisis de rayos X9. Los diferentes métodos, así como las diferentes células utilizadas, pueden explicar el aumento dos veces menor informado por el estudio anterior9. Además, se observó que la monensina aumentó aún más el [Na+]i de las células HCC humanas y murinas, pero no afectó significativamente el nivel de Na+ de las HP (Fig. 4a). El [Na+]i milimolar se extrapoló utilizando la relación determinada experimentalmente entre los mg de proteínas celulares por número de células y una estimación del volumen celular (Figura complementaria 3).

una captación de Na+ de células C1C7 y HepG2 y de hepatocitos (HP) incubados con (M) o sin (C) Monensina 10 μM en Krebs ± Na+ o DMEM (medio de cultivo) + Na+ (n ≥ 3 experimentos independientes). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 con la prueba t de Student. b Fluorescencia ING de células C1C7 y HepG2 y de HP incubadas con (M) o sin (C) monensina 10 μM en Krebs ± Na+. Los valores se expresan como % de los valores de control respectivos: el mismo tipo de células (hepatocitos, células C1C7 o HepG2) incubadas en ausencia de monensina en el mismo momento de incubación (n = 8 experimentos independientes). ***P < 0,001 con análisis de varianza O-way (ANOVA) Prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni. Los símbolos o barras representan el promedio, mientras que las barras de error representan la desviación estándar.

El análisis de imágenes fluorimétricas e in vivo mostró un aumento de la fluorescencia de ING-AM que precedió a la aparición de la toxicidad de la monensina (Figs. 4b y 1c, videos complementarios 1, 2 y 5). Células HCC cargadas con ING-AM teñidas conjuntamente con el tinte Red MitoTracker para resaltar las mitocondrias polarizadas sanas, destacó que ING-AM co-localizó con la fluorescencia de MitoTracker tras el tratamiento con monensina (Fig. 5a, b, Fig. 4a, by suplementaria). vídeos 6 a 9), probablemente indicando un aumento del contenido de Na+ mitocondrial. Se puede predecir que un aumento en la concentración de cationes en la matriz mitocondrial inducirá hiperpolarización mitocondrial. De hecho, se ha demostrado que la inducción de la entrada de K+ en las mitocondrias aumenta el potencial mitocondrial27,28. En consecuencia, el análisis de JC1 mostró que la monensina aumentó el potencial mitocondrial de las células HCC (Fig. 5b). La incubación de células HCC en condiciones libres de Na + inhibió el aumento de la fluorescencia ING-AM intracelular y mitocondrial, la hiperpolarización mitocondrial y la permeabilidad celular al tinte de detección de citotoxicidad TO-PRO ™ -3 yoduro (Fig. 5a, b, Suplementario). Fig. 4c, d y videos complementarios 3 y 4).

a Imágenes confocales superpuestas representativas de Na+ intracelular (verde: ING) y mitocondrias viables (rojo: MitoTrack). Los núcleos celulares se resaltaron con DAPI (BLU). b Polarización de la membrana mitocondrial (fluorescencia roja/verde JC1-1) de células C1C7 expuestas (M) o no (C) 4 h a monensina 10 μM en DMEM ± Na+ (n = 8 experimentos independientes).**P < 0,01, * **P < 0,001 con prueba T no apareada. c, d Constantes de velocidad de eflujo de moléculas de agua celular (kio) determinadas en células HCC expuestas (M) o no (C) a monensina 10 μM hasta 45 min en DMEM + Na+ (panel c, C1C7 a la izquierda y HepG2 a la derecha ) o Krebs ± Na+ (células C1C7, panel d) (c, d: n ≥ 3 experimentos independientes). Las barras representan el promedio mientras que las barras de error representan la desviación estándar. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 con la prueba t de Student.

Como ion osmóticamente activo, es probable que el Na+ impulse una entrada de agua correspondiente dentro de las células. Por lo tanto, se analizó el papel del aumento del contenido intracelular de Na+ y los efectos de la monensina en relación con el kio de las células cancerosas mediante mediciones relaxométricas por RMN (T1)16,17,18. Las células HCC mostraron un kio en el rango de 6.2-11.1 s-1 en el medio de cultivo que disminuyó significativamente con el tratamiento con monensina (Fig. 5c, d). Curiosamente, no se observó una disminución significativa de kio con la incubación en el tampón libre de Na + (Fig. 5d). Esta observación confirma la hipótesis que correlaciona la disminución de kio con la [Na+]i. Además, la disminución de kio observada puede deberse a la inflamación celular impulsada osmóticamente.

La actividad anti-HCC de Monensin se evaluó mediante tratamiento ip diario a 4, 8 o 16 mg / kg / día a partir del día 10 después de la implantación del flanco del aloinjerto de tumor de ratón (células HepaC1C7) (Fig. 6a y Fig. complementaria 5a). La monensina redujo el tamaño del tumor de CHC a partir del cuarto día de tratamiento con efectos significativos en dosis de 8 y 16 mg/kg/día (Fig. 6a y Fig. Suplementaria 5a). La monensina no afectó la supervivencia, el bienestar general evaluado mediante el seguimiento diario, ni el peso corporal (Figura complementaria 5c) de los ratones. Al final, se sacrificaron ratones para evaluar el daño celular, la actividad de proliferación y los niveles de Na+ tanto del tumor como de los tejidos sanos.

a Crecimiento de aloinjerto de células C1C7 en ratones NSG tratados ip con monensina (8 mg/kg) (MON) o con vehículo (C) (n = 15 ratones de control, n = 15 ratones tratados con MON). b Peso de los tumores de aloinjerto extraídos al momento de la terminación (n = 15 ratones de control, n = 15 ratones tratados con MON). c Imágenes representativas de H&E de tejidos sanos de ratones tratados por vía intraperitoneal con monensina (8 mg/kg) o vehículo. Ampliación: barra de escala = 100 μm. d Imágenes representativas de H&E de aloinjerto tumoral de ratones tratados por vía intraperitoneal con monensina (8 mg/kg) o vehículo. Las áreas necróticas se indican con flechas blancas. Paneles de la izquierda: perfiles de células resaltados en rojo para evaluar la densidad celular (e) y el tamaño (f). Ampliación: barra de escala = 50 o 100 μm. e Cuantificación de la densidad celular tumoral evaluada como células/mm2 en ratones tratados con vehículo o monensina (8 mg/kg). Para cada ratón se utilizaron 20 imágenes representativas (n = 4 controles, n = 14 ratones tratados con MON). f Cuantificación del tamaño celular como EQPC (diámetro de un círculo de área de proyección igual de la célula) en tumores de ratones tratados con vehículo o monensina (8 mg/kg). Para cada ratón se utilizaron 20 imágenes representativas (n = 4 controles, n = 4 ratones tratados con MON). Hpf: campo de alta potencia. Los símbolos o barras representan el promedio, mientras que las barras de error representan la desviación estándar. P < 0,05, ***P < 0,001 mediante prueba T no apareada.

La monensina no provocó evidencia morfológica de daño, ni afectó el peso de órganos vitales como el hígado, los pulmones, el bazo, los riñones, el corazón y el cerebro (Figuras complementarias 5b y 6a y Figura 6c). La monensina no cambió la morfología y celularidad celular en el intestino y la médula ósea (BM) (Fig. 7c, e y Fig. 6b complementaria), ni disminuyó la expresión del índice proliferativo ki67 (Fig. 7c-f y Fig. 6b complementaria). Figura 6b). Además, la monensina no afectó la hematopoyesis de los ratones NSG tratados (Fig. 7g y Fig. complementaria 8): número total de células de MO, porcentaje de CD45+ (leucocitos), Ter119+ (linaje eritroide), Gr1+ (linaje mieloide) y LSK. (Lineage- Sca1+ c-kit+, madre hematopoyética y progenitoras) fueron iguales entre los dos grupos. Además, la frecuencia de las poblaciones de progenitores eritroides únicos, que representan las diferentes etapas de diferenciación de los glóbulos rojos, no se vio afectada por el régimen de Monensina. Además, los tratamientos con monensina no afectaron las células de MO de ratones NSG a los que no se les implantó el tumor (Figuras complementarias 7 y 8).

a Tinción inmunohistoquímica representativa para ki67 de tumor de ratones tratados con monensina (8 mg/kg) (M) o con vehículo (C). Imágenes de alta resolución: perfiles de la celda individual delineados en rojo. Ampliación: barra de escala = 50 o 100 μm. b Los gráficos muestran el porcentaje de células positivas para ki67 en el tumor de ratones tratados con monensina o vehículo. Para cada ratón se utilizaron 20 imágenes representativas. Las columnas representan el promedio, mientras que las barras representan la desviación estándar (n = 4 C, n = 4 M ratones tratados). c Tinción inmunohistoquímica representativa para ki67 del intestino de ratones tratados con monensina o vehículo. Ampliación: barra de escala = 50 o 100 μm. d Porcentaje de células positivas para ki67 en el intestino de 4 ratones diferentes tratados con Monensina o con vehículo. Para cada ratón se utilizaron 20 imágenes representativas. Las columnas representan el promedio, mientras que las barras representan la desviación estándar (n = 4 controles, n = 4 M ratones tratados). e Tinción inmunohistoquímica representativa para ki67 de médula ósea de ratones tratados con monensina o vehículo. Ampliación: barra de escala = 50 o 100 μm. f Porcentaje de células ki67 positivas en médula ósea de ratones tratados con Monensina o con vehículo. Para cada ratón se utilizaron 20 imágenes representativas. Las columnas representan el promedio, mientras que las barras representan la desviación estándar (n = 4 controles, n = 4 M ratones tratados). g Gráficos de barras que muestran el número total de células, el porcentaje de leucocitos CD45+, de progenitores RBC Ter119+ totales y relativos, de granulocitos Gr1+; del número y porcentaje de LSK en BM de ratones NSG inyectados con tumor; las columnas representan el promedio mientras que las barras representan la desviación estándar; los puntos representan ratones individuales (n = 3 controles, n = 3 M ratones tratados). Pruebas estadísticas: b, d, f ns (no significativo) con prueba T no apareada; g no significativo con la prueba U de Mann Whitney no paramétrica no apareada; gráfica con % de estadio de maduración de glóbulos rojos, no significativo con ANOVA de dos vías con prueba de comparación múltiple de Sidak.

La monensina a 8 y 16 mg / kg inhibió significativamente el desarrollo de CHC (Fig. 6a y Fig. 5a complementaria) y redujo el peso del CHC (Fig. 6b) al final del estudio. Estos efectos no se correlacionaron con una reducción de ki67 (Fig. 7a, b), como se observa en tejidos proliferativos no transformados. Por el contrario, la inhibición del HCC por parte de la monensina se asoció con un daño tumoral extendido y necrosis, como lo demuestran las observaciones histológicas (Fig. 6d), y que se midió mediante una disminución de la densidad celular (Fig. 6f), como se informó anteriormente29. De acuerdo con la disminución del kio de agua inducida por los tratamientos con Monensina in vitro (Fig. 5c, d), las células HCC del aloinjerto en ratones tratados con Monensin demostraron una inflamación celular significativa en comparación con las de los controles del vehículo (Fig. 6e).

Las concentraciones intracelulares de Na+, determinadas por ICP-MS, fueron notablemente más altas en los tumores que en los hígados normales y en todos los demás órganos investigados (Fig. 8a). Curiosamente, los ratones tratados con monensina mostraron un aumento sustancial en la concentración de Na+ en el tejido tumoral con respecto a los controles no tratados (Fig. 8a). Este aumento fue específico solo de los tejidos tumorales, y las concentraciones de Na+ en otros órganos no se vieron afectadas por el tratamiento con monensina (Fig. 8a).

a contenido de tejido Na+ medido por ICP-MS en tumores y órganos recolectados de ratones NSG al final del tratamiento con Monensina (M, administración ip de 8 mg/Kg) o vehículo (C) (n ≥ 3C y n ≥ 3M tratados ratones). b Imágenes de resonancia magnética del tumor seleccionadas del ratón control (a, b) y tratado (c, d) adquiridas 16 días después de la inoculación de células C1C7 (T16): a, c imágenes ponderadas en T2 de protones y su fusión con las imágenes de 23Na correspondientes ( b, d, la barra de color indica el tejido milimolar [Na+] calculado a partir de la intensidad de la señal de la muestra de referencia). c Cambio porcentual promedio calculado en todo el tumor a partir de las imágenes de resonancia magnética con 23Na (ver texto). (n = 4C yn = 3M ratones tratados). El tiempo (días) después de la inoculación de células C1C7 se indica en los ejes x. Las barras representan el promedio mientras que las barras de error representan la desviación estándar. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (prueba t de Student).

Los resultados obtenidos con el análisis ICP-MS fueron confirmados por resonancia magnética con 23Na, que es capaz de sondear directamente y de forma no invasiva las concentraciones de Na+ en el tejido. Las exploraciones por resonancia magnética se realizaron en dos grupos de ratones: ratones con tumor de HCC tratados con monensina (imágenes c, d de la figura 8b) en comparación con un grupo de control no tratado (imágenes a, b de la figura 8b). La Figura 8C muestra la intensidad de la señal de los tumores (expresada como cambio porcentual promedio) en el grupo tratado con monensina y en ratones de control, lo que demuestra, aunque no es significativo, una tendencia ascendente. Utilizando tubos estándar que contenían agar embebido con una solución de NaCl 75 mM (Fig. 8b), fue posible extrapolar la concentración de tejido de Na+ intratumoral que se correlacionaba con las mediciones de ICP-MS realizadas post mortem en los mismos tejidos tumorales (Tabla complementaria 1). Además, el tejido tumoral [Na+] de cada ratón medido durante los 5 días del tratamiento con monensina se informó en la Fig. 9 complementaria. Durante el tratamiento observamos un aumento progresivo de las regiones hiperintensas (Fig. 10 complementaria) que probablemente correspondían a Tejidos tumorales necróticos.

Este estudio investigó la homeostasis del Na+ como un nuevo objetivo para inhibir el CHC. Demostramos que las células y los aloinjertos de HCC tienen un mayor contenido de Na+ en comparación con las células y tejidos sanos, y que el tratamiento con el ionóforo de Na+ Monensina aumenta aún más estos niveles sin afectar los niveles de Na+ de los tejidos sanos. Descubrimos que un aumento de Na+ selectivo para el cáncer se correlacionaba con la destrucción de células de HCC y una tasa de crecimiento más lenta de los tumores de xenoinjerto de HCC. Aquí, informamos por primera vez la caracterización de los eventos celulares involucrados en este proceso. Nuestros resultados muestran que: (i) las células HCC son, a diferencia de los hepatocitos sanos, específicamente sensibles a la acción tóxica del ionóforo de Na+, siendo energéticamente incapaces de compensar y sobrevivir a la carga de Na+ inducida farmacológicamente; (ii) la deficiencia energética de las células HCC se asoció con alteraciones de la capacidad respiratoria mitocondrial dependientes de Na+. Varias observaciones apoyan estas suposiciones.

Descubrimos que la prevención del aumento de Na+ intracelular mediante el empleo de medios de incubación de células libres de sodio previno la muerte celular de HCC inducida por monensina, destacando una dependencia del sodio de la acción citotóxica específica del cáncer del ionóforo. Observamos los efectos protectores de los medios libres de Na+ empleando un tampón salino (es decir, Krebs Henseleit), utilizado previamente en nuestro estudio inicial sobre el papel de las alteraciones intracelulares de Na+ en los mecanismos finales de la muerte primaria de los hepatocitos después del agotamiento de ATP6,7, 8, y un medio de cultivo DMEM libre de sodio modificado a medida preparado específicamente para el presente estudio. Estas condiciones experimentales impidieron las acciones tóxicas de Monensin sin alterar el pH intracelular6. La monensina generalmente se considera un ionóforo de sodio, pero también puede mover diferentes cationes a través de la membrana19,20. Sin embargo, la concentración de sodio en el medio extracelular es mucho mayor que la de cualquier otro catión, por lo que es probable que el sodio sature la actividad de transporte de cationes de Monensin, ya que la concentración relativa de sodio extracelular es de 145 mM y la de Monensin administrada es de 10 μM. . Todos los experimentos realizados en condiciones libres de sodio mostraron una “prevención” de las alteraciones celulares y de la citotoxicidad inducida por Monensin. Por lo tanto, en conjunto indican que los efectos tóxicos observados de Monensin dependían del sodio y, por lo tanto, estaban directamente relacionados con la capacidad de Monensin para mover específicamente el sodio dentro de las células.

La monensina no afectó los niveles de ATP ni la viabilidad de los HP primarios. Por el contrario, la destrucción de las células HCC por parte de la monensina fue precedida por una pérdida progresiva de ATP y la prevención del aumento de sodio por parte de las células incubadas en ausencia de Na+ extracelular, un agotamiento de la energía rescatada y la aparición de muerte celular. La monensina no inhibió directamente la Na+/K+ ATPasa basal, pero el bloqueo farmacológico de la bomba de Na+/K+ eliminó la resistencia de los HP a la monensina y aumentó sus efectos citotóxicos en las células HCC. Esto sugiere que la sensibilidad de las células HCC a la monensina está relacionada con su incapacidad energética para mantener la homeostasis del Na+ alimentando eficientemente la extrusión de Na+.

La producción de ATP en las células HCC se basa principalmente en la glucólisis anaeróbica25. Demostramos que la monensina aumentó la actividad glucolítica tanto en células HCC como en HP. Tal efecto dependía del sodio y, por lo tanto, era una probable respuesta a la mayor necesidad energética para extruir el exceso de [Na+]i. A su vez, el aumento de especies ácidas como consecuencia de la activación glicolítica promovería aún más el influjo de Na+ a través de los sistemas tampón de pH dependientes de Na+4,5, contribuyendo así a la carga de Na+.

La mayoría de las células cancerosas tienen mitocondrias funcionales30 y pueden emplear la fosforilación oxidativa (OxPhos) para mantener la producción de ATP. Demostramos que la monensina aumentaba el contenido de Na+ mitocondrial y disminuía, mediante un mecanismo dependiente de Na+, la respiración tanto intacta como ligada a ATP en células HCC, pero no en HP. Actualmente se desconocen los mecanismos moleculares de tales perturbaciones inducidas por Na+. Sin embargo, análisis previos de microscopía electrónica de las mitocondrias de los fibroblastos L929 expuestos a monensina resaltaron la aparición de cambios estructurales como espacios intracristalinos desorganizados y expandidos31. Además, la elegante caracterización de la actividad anticancerígena de Gboxin mostró recientemente un papel patogénico clave con su acumulación en las mitocondrias como una molécula cargada positivamente29. Estas observaciones indican una tendencia de las mitocondrias a actuar como un sumidero de cationes intracelular. Esta tendencia, si se sobrecarga (es decir, por una carga intracelular forzada de Na+), puede ser la causa de disfunción mitocondrial funcional y estructural y de pérdida de la producción de ATP mitocondrial. En conjunto, estas observaciones sugieren que el [Na+]i constitutivamente alto, aumentado por el influjo continuo de Na+ inducido por la monensina y por el metabolismo glucolítico, conduce a la inhibición respiratoria mitocondrial. Esto crea un círculo vicioso de mayor consumo energético y estrés energético irreversible que hace que las células HCC sean incapaces de mantener, a diferencia de las HP sanas, un nivel de Na+ intracelular compatible con la vida.

Nuestras primeras investigaciones con HP primarios6,7,8 indicaron que en condiciones de agotamiento de energía, un desequilibrio de la presión osmótica intracelular dependiente de Na+ explicaba la pérdida de la integridad de la membrana plasmática y la muerte de HP. Ahora hemos podido obtener imágenes y analizar estos eventos, lo que muestra que la monensina aumenta progresivamente la [Na+]i antes de la aparición de la muerte celular del CHC y demuestra un aumento de la retención de agua intracelular dependiente de Na+. En consecuencia, mostramos in vivo un aumento del tamaño de las células en aloinjertos de CHC de ratones tratados con monensina y, mediante resonancia magnética con 23Na, la asociación de la acumulación intratumoral de Na+ con la aparición de señales hiperintensas que probablemente correspondan a áreas necróticas.

Una cuestión crucial en la terapia contra el cáncer es minimizar/evitar sus efectos nocivos sobre los tejidos normales. Demostramos que Monensin mostró su acción citotóxica específicamente en células transformadas y tumores sin alterar el bienestar general de los ratones, la integridad de los órganos vitales y sin mostrar un efecto citostático ni en tejidos normales ni transformados. Es importante destacar que observamos la falta de actividad antiproliferativa de Monensin en la mucosa intestinal y la MO, que a menudo son sensibles a la mayoría de los medicamentos contra el cáncer. Mediante una evaluación precisa del proceso de hematopoyesis, también demostramos que la monensina carecía de efectos sobre la celularidad y las etapas de diferenciación de las células madre hematopoyéticas y sus progenitores, incluidos todos los linajes de células eritropoyéticas.

No se esperaba la falta de efectos antiproliferativos de Monensin en nuestros modelos de CHC alogénico, ya que investigaciones previas sobre la actividad anticancerígena de Monensin informaron la inhibición de vías relacionadas con la proliferación celular20,21,22,23,24. Sin embargo, los efectos anticancerígenos de Monensin nunca se habían evaluado previamente en líneas celulares de tumores hepáticos. Además, nuestra configuración experimental difiere de informes anteriores. De hecho, realizamos tratamientos con monensina en condiciones libres de suero para reproducir el entorno in vivo donde las células de un tumor sólido pueden tener un contacto directo limitado o nulo con la proteína sérica32.

En este estudio empleamos ratones NGS para analizar claramente el efecto directo de la monensina en las células tumorales en ausencia de respuestas anticancerígenas concomitantes de reacciones inmunoinflamatorias. Será esencial en futuras investigaciones emplear modelos inmunocompetentes para investigar simultáneamente los efectos de los ionóforos de Na+ sobre la inmunoinflamación.

El alto contenido intracelular de Na+ está asociado con un pH intracelular alcalino y con un gradiente de pH inverso, condiciones que se sabe que son permisivas para la proliferación, migración e invasión de células cancerosas1,2. Mostramos que estas condiciones, generalmente consideradas ventajosas para las células cancerosas1,2, pueden convertirse en un estado específico de debilidad del cáncer si se exacerban con fármacos ionóforos de Na+, destacando así la homeostasis del Na+ como un nuevo objetivo para la terapia del CHC. La homeostasis del Na+ está regulada tanto en células normales como cancerosas por sistemas ubicuos (es decir, Na+/K+ ATPasa o transportadores tampón de pH dependientes de Na+) cuyo principal papel fisiológico en los tejidos sanos hace que su manipulación sea potencialmente problemática en las clínicas. Nuestros datos in vivo demuestran que el tratamiento con el antibiótico monensina es una alternativa segura para alterar la homeostasis del Na+ en las células HCC sin afectar los tejidos normales.

Los potentes efectos anticancerígenos de los ionóforos catiónicos están bien establecidos. En 2009, entre 16.000 compuestos analizados, sólo el análogo de la monensina, la salinomicina, fue capaz de matar células madre cancerosas humanas con una eficacia 100 veces mayor que el fármaco quimioterapéutico comúnmente utilizado, el paclitaxel33. Más recientemente, un análisis de alto contenido identificó a la monensina como el compuesto citotóxico más potente, entre los 2.640 analizados. en células de transición epitelial a mesenquimatosa34. Sorprendentemente, con una actividad anticancerígena tan potente y un número cada vez mayor de estudios preclínicos “in vitro” e “in vivo”, la monensina nunca ha sido investigada para estudios traslacionales en humanos. El uso potencial de Monensin en la clínica no ha sido discutido hasta ahora debido a tres casos reportados de toxicidad humana tras la ingestión accidental de Monensin35,36, y debido a la alta variabilidad de los efectos tóxicos en diferentes especies37.

En este estudio proporcionamos, por primera vez, la prueba del concepto de una acción citotóxica selectiva contra el cáncer de la monensina, mostrando la capacidad del ionóforo para aumentar específicamente el contenido de sodio no solo en las células HCC sino también en los aloinjertos de HCC, destacando la sensibilidad de las células HCC a esta carga de Na+ inducida farmacológicamente. Estas importantes observaciones enfatizan la necesidad de impulsar un análisis más profundo de los ionóforos catiónicos, tanto nuevos como análogos de monensina desarrollados previamente38, con el objetivo de abordar dosis efectivas más bajas para su empleo seguro como nuevos agentes terapéuticos contra el CHC y, potencialmente, contra el cáncer en general.

Colagenasa (Tipo I), N-(2-hidroxietil)-piperazina-N′-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES), suero fetal bovino (FBS), gentamicina (G), penicilina (P), estreptomicina (S) , glutamina (Gln), piruvato de Na+ (Na+ Pyr), oligomicina, FCCP, rotenona, antimicina, ouabaína, monensina, azul tripán, yoduro de propidio, (2-hidroxipropil)-b-ciclodextrina (HPCD) y todos los productos químicos para tampón y Las preparaciones de reactivos se adquirieron en Sigma-Aldrich (Milán, Italia).

El medio mínimo esencial de Eagle (EMEM), el kit de ensayo de proteína Pierce BCA, el 3-yoduro To-PROTTM y los CMXRos rojos MitoTracker fueron de Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, EE. UU.). El medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y el DMEM libre de Na+ modificado a medida (DMEM - Na+) sin ningún componente de Na+ se obtuvieron de GIBCO (grupo SIAL, Roma, Italia).

Los kits de ensayo de ion Natrium Green y lactato se obtuvieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido).

JC-1 era de Adipogen Life Sciences (Liestal, Suiza).

El ensayo de proteína Pierce BCA y los ensayos para ATP (CellTiter) y detección de citotoxicidad (CelltOX) fueron de Promega (Madison, Wisconsin, EE. UU.).

Gd-HPDO3A (Prohance) fue proporcionado amablemente por Bracco Imaging SpA, Bracco Research Centre (Colleretto Giacosa, TO, Italia).

Los hepatocitos (HP) se aislaron mediante perfusión hepática de ratones con colagenasa y posteriores centrifugaciones diferenciales a 50 g durante 5 min a 4 °C, como se informó anteriormente37. Luego se sembraron suspensiones de hepatocitos en placas de cultivo recubiertas de colágeno y se cultivaron durante 24 h en DMEM (sin glutamina) que contenía FBS al 10%, P 100 U/ml, glutamina (Gln) 6 mM y S 100 μg/ml, antes. a los tratamientos.

Las células de hepatoma murinas Hepa1c1c7 (C1C7) fueron suministradas por ECACC (Salisbury, Reino Unido) y las células humanas HepG2 por ATCC (Manassas, VA, EE. UU.). Se cultivaron de forma rutinaria en DMEM sin glutamina, suplementado con 10% de FBS, 100 U/ml de P, 6 mM de Gln, 100 μg/ml de S y medio EMEM suplementado con 10% de FBS, 100 U/ml de P con 100 μg. /ml S y piruvato Na+ 1 mM (Na+ Pyr), respectivamente. Las células se mantuvieron en una cámara humidificada con 5% de CO2/95% de aire a 37 °C y se dividieron cada 1 a 3 días. Todas las células dieron negativo para micoplasma utilizando el kit de detección de micoplasma MycoAlert™. Todos los materiales se compraron en Lonza (Basilea, Suiza).

Las células HP, C1C7 o HepG2 se suspendieron (densidad celular de 106/mL) en tampones de Krebs-Henseleit oxigenados con una concentración de sodio normal (145 mM) (Krebs + Na+), o sin ningún componente de sodio (Krebs - Na+), que contenía 20 nmol. /L HEPES (pH 7,4) y se incubaron a 37 C° bajo flujo con una mezcla de gas 95% O2/5% CO2, según nuestros estudios previos en hepatocitos primarios de roedores6,7,8. Tanto en los Krebs libres de Na+ como en los DMEM libres de Na+, el sodio se sustituye por colina para mantener la osmolaridad normal del medio. Cuando estaba indicado, las células se trataron con monensina (10 μM) o se preincubaron durante 15 minutos con glucosa (5 mM) u ouabaína (1 mM).

Alternativamente, se suspendieron células HPs, C1C7 o HepG2 en ausencia de suero en DMEM con alto contenido de glucosa (5 mM) y contenido normal de sodio (145 mM) DMEM (+Na+), o sin ningún componente de sodio DMEM (-Na+) ( GIBCO, SIAL, Roma, Italia). Las células se sembraron a una densidad celular de 106/ml o por cuadruplicado en placas de cultivo de 96 pocillos (5000 células/pocillo) en presencia o en ausencia de monensina (0,5, 1, 2,5, 5, 7,5 o 10 μM). El grupo SIAL preparó DMEM (-Na+) reflejando los cambios en la composición de la sal de Krebs (-Na+)6,7,8 y dejando sin cambios todos los demás componentes de DMEM.

La viabilidad celular y el ATP intracelular se determinaron utilizando, respectivamente, los protocolos CellTox y Cell-Titer (Promega; Madison, Wisconsin, EE. UU.). Los valores de ATP se corrigieron excluyendo el ATP liberado por las células muertas, según lo determinado mediante análisis CellTox y Cell-Titer simultáneos realizados para cada muestra. En resumen, en los momentos de tratamiento indicados, se tomaron 50 µl de células (5000 células/pocillo en un formato de 96 pocillos) y se agregaron a una placa de ensayo opaca si estaban en suspensión, o se procesaron directamente si ya se sembraron. Luego se añadió un volumen de 20 µl de reactivo CellTox a cada pocillo y se midió la fluorescencia a una excitación de 485 nm y una emisión de 520 nm. Luego se añadió un total de 100 µl/pocillo de reactivo CellTiter a la placa que contenía el tinte verde CellTox™ y las células tratadas experimentalmente, tras lo cual se midió la luminiscencia.

La actividad basal de Na+/K+ ATPasa y la liberación extracelular de lactato se midieron respectivamente con los kits de ensayo MyBiosource (San Diego, California, EE. UU.) y Abcam (Cambridge, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para evaluar la actividad Na+/K+ ATPasa, se añadió un total de 2 x 106 células a 400 µl de tampón de ensayo de ATPasa enfriado con hielo y se incubaron a 25 °C durante 30 minutos antes de medir la densidad óptica a 650 nm. La viabilidad, el ATP intracelular, la actividad Na+/K+ ATPasa y la liberación de lactato se expresaron como % de una cantidad igual de proteínas (ensayo de proteína Pierce BCA, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) según las muestras tratadas con vehículo.

La respiración celular se determinó mediante respirometría de alta resolución utilizando el protocolo de sustrato, desacoplador, inhibidor y titulación (SUIT), como se describió anteriormente38. Las células C1C7 se incubaron durante 4 h en presencia o ausencia de monensina 10 μM en DMEM (+ Na+) o en DMEM (-Na+). Al final de los tratamientos, las células se centrifugaron a 300 g durante 5 min. Los pH del sobrenadante se evaluaron inmediatamente utilizando un medidor de pH ACH HQ440D (Lainate, Mi, Italia) equipado con un microelectrodo. Los pellets se resuspendieron en medio de respiración mitocondrial MiR05 (EGTA 0,5 mM, MgCl2 · 6H2O 3,0 mM, lactobionato de potasio 60 mM, taurina 20 mM, KH2PO4 10 mM, HEPES 20 mM, sacarosa 110 mM, albúmina sérica bovina 1 g/l, pH 7,1). ) y se transfirió a un respirómetro de alta resolución Oxygraph-2 K (Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria). Las muestras de control y tratadas se evaluaron simultáneamente. Después de una estabilización inicial del flujo de O2, se usó piruvato (5 mM) para mantener la respiración ligada a TCA. Se añadió el inhibidor de la ATP sintetasa, oligomicina (O), a una concentración final de 5 nM, y se cuantificó el consumo de oxígeno para determinar la respiración sensible e insensible a la oligomicina. Las tasas de consumo de oxígeno se calcularon utilizando el software adjunto (DatLab7, Oroboros). Las tasas de consumo (flujo) de O2 se normalizaron con respecto a la proteína total.

Se cargaron células HP primarias de ratón, C1C7 o HepG2 con el colorante fluorescente Na+ intracelular ION NaTRIUM Green-AM (5 µM) en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con BSA (2%), ácido plurónico (10 µM) y glucosa ( 10 mM) durante 1 h a temperatura ambiente. Las variaciones de Na+ intracelular tras el tratamiento con monensina se controlaron de forma rutinaria utilizando un espectrofluorómetro Kontron SFM25 ajustado a longitudes de onda de excitación de 525 nm y de emisión de 545 nm y se expresaron como % de los valores de control.

Las células C1C7 se sembraron en placas de 3 x 104 células/pocillo en una placa de 48 pocillos durante 24 h en DMEM suplementado con FBS al 10%. Para los tratamientos, las células se lavaron con DMEM fresco con o sin Na+ y luego se expusieron durante 4 h a monensina o DMSO 10 µM en DMEM (+ Na+) o en DMEM (-Na+) en ausencia de FBS. Después del tratamiento, las células se incubaron en presencia de 10 µg/ml de JC-1 añadido al medio de cultivo durante 15 minutos a 37 °C en la oscuridad. Las imágenes se adquirieron con un microscopio de fluorescencia (EVOS™ XL Core Imaging System, Thermo Fisher Scientific) y se analizaron utilizando el software ImageJ v 1.53e, calculando la relación de fluorescencia rojo/verde (fluorescencia: medida a una absorbancia de 490/525 nm y 540 /525 nm).

Las células C1C7 se sembraron en una placa de 96 pocillos durante 24 h en DMEM suplementado con FBS al 10%, luego se cargaron con el colorante fluorescente Na+ intracelular ION NaTRIUM Green-AM. Después de lavar con DMEM suplementado con FBS al 10%, las células se trataron con monensina (10 µM) en presencia del tinte de yoduro TO-PRO™-3 impermeable a las células (1 µM) para teñir selectivamente los núcleos de las células muertas. Las células se incubaron en atmósfera controlada (5% CO2; 37 °C) durante 20 h en DMEM (+ Na+) o en DMEM (-Na+) en la incubadora de jaula del THUNDER Imager 3D Live Cell (Leica Microsystems; Alemania). Las variaciones intracelulares de Na+ y la apariencia de la muerte celular se registraron cada 30 minutos empleando un protocolo de grabación/análisis semiautomático de la plataforma de generación de imágenes de células vivas Thunder. Los controles negativos se realizaron utilizando muestras cargadas con tintes singulares o sin tintes. Los cambios de fluorescencia se analizaron utilizando el software ImageJ v 1.53e.

La visualización del sodio y del colorante TO-PRO-3 en las células C1C7 en un cultivo monocapa se logró utilizando un microscopio de campo amplio (Leica DMI8, Thunder 3D Live Cell Imaging System) equipado con un motor de luz Spectra X o LED8 multi- Fuente de luz LED (Leica Microsystems; Alemania) y cámara sCMOS DFC9000GT de 4,2 MP (Leica Microsystems; Alemania). Las imágenes multicanal fluorescentes y de campo claro se adquirieron utilizando un objetivo 20X (N PLAN L 20x/0,35 DR; Leica Microsystems, Alemania).

Se utilizaron diferentes combinaciones de luz de excitación LED y cubos de filtro fluorescente para visualizar las sondas fluorescentes: TO-PRO-3 (excitación de 640 nm, juego de filtros DFT51011), ION NaTRIUM Green-AM (excitación de 500/20 nm, cubo de filtro YFP). Se aplicaron parámetros idénticos para todas las imágenes cuantificadas. Todos los datos se guardaron como archivos LIF hasta su posterior procesamiento.

Las células C1C7 se sembraron en cubreobjetos durante 24 h, luego se cargaron con el colorante fluorescente intracelular Na+ ION NaTRIUM Green-AM, como se describió anteriormente. Después de un lavado con 1X PBS, los cubreobjetos con las células adheridas se colocaron en DMEM con o sin Na+ Monensina (5 µM) durante 4 h. Una vez finalizado el tratamiento, las células se tiñeron con 100 nM del colorante fluorescente mitocondrial sensible al potencial MitoTracker Red [45 min, atmósfera controlada (5% CO2; 37 °C)]. Luego, las células se tiñeron con 0,5 mg/ml del colorante fluorescente diclorhidrato de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Sigma-Aldrich) durante 5 minutos a temperatura ambiente para resaltar los núcleos celulares. Luego las células se lavaron con PBS 1X y se fijaron con paraformaldehído al 4%. Los controles negativos se realizaron utilizando muestras sin colorantes. La grabación secuencial de imágenes se realizó en modo unidireccional con un sistema de microscopio confocal Leica SP8 (Leica Microsystems; Alemania). El DAPI se excitó con un láser de 405 nm y se recogieron emisiones de 410 a 509 nm; el ING se excitó con un láser de 514 nm y se recogieron emisiones de 519 a 589 nm; el Mitotracker se excitó con un láser de 633 nm y se recogieron emisiones de 638 a 776 Nuevo Méjico. Las imágenes se adquirieron utilizando un objetivo Leica HC PL APO CS2 63 × / 1,40 OIL a 999,66 mili unidades de absorción (mAU).

Se tomaron imágenes de las muestras utilizando un microscopio confocal de barrido láser Leica SP8, equipado con un láser de argón y una lente Leica HC PL APO CS2 63 ×/1,40 OIL. El tamaño del orificio se estableció en 1 AU. Las muestras se iluminaron con láseres de 405, 514 y 633 nm a 0,75, 1,50 y 3,0 mW, respectivamente. Se adquirieron imágenes de 1024 × 1024 píxeles a 600 Hz (velocidad de escaneo) utilizando detectores HyD y PMT. Los parámetros de adquisición DAPI fueron: 410-509 nm (rango de recolección de longitud de onda de emisión), 0 (ganancia) y 0 (compensación). Los parámetros de adquisición de ION NaTRIUM Green-AM fueron: 519-589 nm (rango de recolección de longitud de onda de emisión), 0 (ganancia) y 0 (compensación), los parámetros de adquisición de MitoTracker Red fueron: 638-776 nm (rango de recolección de longitud de onda de emisión), 0 (ganancia ) y 0 (desplazamiento). Se aplicó un promedio de línea de 1 a todos los canales. Todos los datos se guardaron como archivos LIF hasta su posterior procesamiento.

La determinación de kio se realizó según lo descrito previamente por Ruggiero et al.16,17,18. Las células C1C7 y HepG2 se sembraron en un matraz de 175 cm2 a una densidad de 10-12 x 106 células/matraz. Las células se separaron con tripsina al 0,05% y EDTA al 0,02%.

El sedimento recuperado se resuspendió en el tampón de Krebs, o en el tampón de Krebs sin Na+ o en el medio de cultivo, en presencia del vehículo (DMSO) o monensina 10 µM (muestra de control y tratada, respectivamente). En el caso de la resuspensión en tampón se realizó un paso de lavado previo en el mismo tampón. Durante los tiempos de tratamiento (15, 30 o 45 minutos), las células se mantuvieron a 37 °C y 5% de CO2.

Después del tratamiento, las células se centrifugaron y se resuspendieron en 1 ml de la solución anterior a la que se añadió Gd-HPDO3A 10 mM (Prohance). Las mediciones relaxométricas se llevaron a cabo en 15 minutos, durante los cuales las suspensiones celulares se transfirieron a tubos de RMN de 5 mm y se centrifugaron durante 5 minutos a 0,1 rcf (4 °C). El protón de agua T1 de los gránulos celulares se midió a 0,5 T y 25 °C en un espectrómetro Stelar SPINMASTER (Stelar, Mede, PV, Italia) utilizando la secuencia de pulsos de inversión-recuperación (IR) con incrementos de 32 τ (distribuidos logarítmicamente en el rango de 0,01). –4 s de rango) y 2 escaneos. Se observó una recuperación biexponencial de la magnetización. El kio se determinó analizando los datos IR en términos del modelo 2SX [14-16, 18) usando la ecuación descrita en el siguiente párrafo.

En una suspensión celular, las moléculas de agua se distribuyen en el espacio extracelular (ex) y en el citoplasma intracelular (in), y se intercambian entre los dos compartimentos con una tasa de intercambio de agua y una tasa de eflujo constante kio (=τin−1, el tiempo de residencia intracelular promedio). recíproco) y la tasa de afluencia constante koi (=τex−1, el tiempo de residencia extracelular promedio recíproco), respectivamente. Estos parámetros están relacionados por el equilibrio de masa kio ∙ Vi = koi∙Vex, donde Vin y Vex (=1−Vin) son las fracciones molares de agua intracelular y extracelular, respectivamente.

Desde el punto de vista relaxométrico, cada entorno se caracteriza por su propia constante de tasa de relajación longitudinal de protones, las constantes de tasa de relajación longitudinal extracelular (R1ex) e intracelular (R1in).

La adición de una concentración suficiente del agente de contraste extracelular (CA) Gd-HPDO3A a la suspensión celular permitió la condición kio + koi ~ |R1ex-R1in| estar satisfecho. Como tal, el intercambio de agua modula el comportamiento de relajación observado, como lo describen las ecuaciones de Bloch-McConnell14,15,39,40. La recuperación de la magnetización longitudinal después de la inversión no es monoexponencial y se expresa como:

donde Mz es la magnetización instantánea, M0 es su valor de equilibrio de Boltzmann, aL y R1L son la fracción y la constante de velocidad para el componente aparente con el T1 más largo (T1L = R1L–1), aS y R1S son la fracción y la constante de velocidad para la componente aparente con el T1 más corto (T1S = R1S–1), y t es el tiempo de carrera para la recuperación por relajación. Debido a que aL y aS están relacionados (aS + aL = 1), sólo hay tres parámetros independientes: R1L, R1S y aS (o aL), expresados ​​como:

donde R1ex0 es la tasa de relajación extracelular sin CA, [CA] es la concentración milimolar de CA en el espacio extracelular y r1 es su valor de relaxividad.

La concentración de Gd en el sedimento se determinó mediante un método relaxométrico, después de la mineralización de la muestra durante la noche en HCl 6 M a 120°. El tratamiento provocó la digestión de la matriz y la liberación del metal como acuión libre. El R1 de esta solución se midió a 21 MHz y 25 °C en un relaxómetro Stelar SpinMaster (Mede, Pavía, Italia) y la concentración de Gd se calculó utilizando una curva de calibración personalizada obtenida a partir de soluciones estándar de GdCl341,42,43.

Dado que los complejos metálicos se distribuyen sólo en Vex, este último se determinó siguiendo la relación:

donde nGd es el número de moles de Gd determinado por relaxometría; y MGd es la concentración de la solución de Gd-HPDO3A añadida a las células, y Volp es el volumen de los sedimentos celulares húmedos.

Para los experimentos de absorción, las células se separaron como se informó anteriormente para el experimento relaxométrico para obtener un sedimento de aproximadamente 2 millones de células. Para la absorción de Na+, las células se suspendieron en 1 ml de tampón (Krebs con o sin Na+) o medio de cultivo y se incubaron (37 °C, 5 % de CO2) en presencia del vehículo (DMSO) o monensina 10 µM durante 15, 30 o 45 min. Luego, las células se lavaron tres veces con 15 ml de tampón Krebs sin Na+ frío y se volvieron a precipitar mediante centrifugación (0,2 rcf, 4 °C). Las células se recuperaron añadiendo 200 µL de agua bidestilada. En el caso del experimento de absorción de rubidio, el protocolo fue el mismo, excepto por la presencia de RbCl 0,22 mM en 1 ml de solución de suspensión y por los tiempos de incubación (5, 15 y 30 min).

Después de la sonicación, la concentración de proteína de la muestra se evaluó mediante el ensayo de Bradford. Luego, las muestras celulares se digirieron después de la adición de la misma cantidad de HNO3 (70%), utilizando un programa de calentamiento por microondas (ETHOS UP Milestone, Bérgamo, Italia) que consistió en una rampa hasta 150 °C en 8 min, seguido de 6 min a 150°C. Después de la mineralización, se agregaron 3 ml de agua ultrapura a las muestras para el análisis ICP-MS. La cuantificación de Na+ y Rb+ se realizó mediante análisis ICP-MS (Element-2; Thermo-Finnigan, Rodano (MI), Italia). Las curvas de calibración se obtuvieron utilizando soluciones estándar de Na y Rb (Sigma-Aldrich) en el rango de 0,7 a 0,2 μg/ml y de 0,2 a 0,005 μg/ml para Na+ y Rb+, respectivamente. Los resultados se expresaron como nmol de Na+ por mg de proteínas y para Rb como diferencia porcentual de absorción de Rb con respecto al control de la siguiente manera:

[(nmol de Rb+ /mg de proteína)t–(nmol de Rb+ /mg de proteína)c]/(nmol de Rb+ /mg de proteína)c × 100 donde t y c indicaron la muestra tratada y de control, respectivamente.

Se mantuvieron ratones NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (Jackson stock No 005557) (NSG) machos adultos de seis a ocho semanas de edad en condiciones libres de patógenos en las instalaciones para animales de la Università del Piemonte Orientale, Departamento de Ciencias de la Salud. y tratado de acuerdo con el Comité de Ética Universitaria y las directrices europeas (autorización del protocolo experimental n. 851/2020-PR, emitida el 19/08/2020 por el Ministerio de Salud italiano para el protocolo n. DB064.60). A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea, en la espalda, células C1C7 (1 x 106 en 100 μl de NaCl al 0,9%/ratón) y se controló diariamente el crecimiento del tumor. Cuando el tamaño del tumor era ~80 mm3 (aproximadamente 10 días después de la inyección de células tumorales), los ratones fueron tratados diariamente con una inyección intraperitoneal de monensina, 4–8–16 mg/kg disueltos en DMSO/HPCD al 10 % en NaCl al 0,9 % (1: 9, v/v), o con vehículo solo (DMSO/HPCD 10 % en NaCl 0,9 % (1:9, v/v). Se emplearon 4 animales para los grupos. Se usaron tumores palpables para la medición con calibre en dos dimensiones para estimar volumen del tumor según la ecuación V = (L × W x W) / 2. El tratamiento se llevó a cabo 10 veces y los ratones fueron sacrificados 2 h después de la última administración o cuando mostraron tolerancia. Al final del experimento, antes Durante la recolección de órganos, los ratones fueron perfundidos con Krebs sin Na+ para eliminar posibles contaminaciones que surgieran del Na+ intravascular.

Se recogieron tejidos de ratón para su fijación en formalina tamponada neutra al 10% y se incluyeron en parafina. Las muestras de médula ósea (MO) se descalcificaron durante 8 h utilizando una solución descalcificante a base de EDTA, se lavaron con agua corriente (1 h) y posteriormente se procesaron e incluyeron en parafina. Se desparafinaron, rehidrataron y tiñeron secciones de cuatro micrones de espesor con hematoxilina y eosina para análisis histopatológicos o con anti-Ki-67 (1:250, Ventana ® Medical Systems, Roche, Monza, Italia) para evaluar la proliferación celular mediante el uso de un inmunotinción automatizada (Ventana, Roche, Monza, Italia). Las imágenes de diapositivas se adquirieron con el escáner de diapositivas Pannoramic MIDI 1.17; Tipo de objetivo: Plan-Apocromático; Ampliación: 20X; Cámara: Zeiss ICc1. El Ki67 y la detección de células, para cuantificar la densidad celular (evaluada como células/mm2) y el tamaño (evaluado como EQPC: diámetro de un círculo de igual área de proyección de la célula), se realizó utilizando la "detección de células positivas" incorporada de QuPath. 42,44 Versión de software: QuPath-0.3.2.

Se recogió un fémur por ratón y se mantuvo en medio frío RPMI 1640 suplementado con 5% de FBS. Las células de BM se recolectaron lavando los huesos con una aguja de 26 G y se pasaron a través de un filtro de células de 40 μm para obtener una suspensión de células individuales. El recuento celular se realizó mediante cámara de Burker utilizando azul tripán para excluir las células muertas. Después del recuento, las células se resuspendieron en tampón FACS (PBS, FBS al 2 %, EDTA 2 mM). Las muestras se tiñeron con anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromo (Tabla 1) contra marcadores de ratón. Se preparó una mezcla maestra de anticuerpos para cada tinción en tampón FACS, donde las células se lavaron y resuspendieron en la mezcla maestra y se incubaron durante 15 minutos a 4 °C. Las muestras se adquirieron en el citómetro de enfoque acústico Attune NxT (Thermo Fisher Scientific) y los análisis se realizaron mediante el software FlowJo v10 (BD Biosciences).

Al final del tratamiento con monensina, los ratones implantados fueron perfundidos con Krebs (-Na+) para eliminar posibles contaminaciones que surgieran del Na+ intravascular y se sacrificaron. Sus órganos fueron recolectados, pesados ​​y digeridos en HNO3 concentrado (70%). Se mineralizaron alícuotas de las muestras digeridas (0,25 ml) calentándolas en microondas (ETHOS UP Milestone, Bérgamo, Italia) siguiendo un programa que consistió en una rampa a 160 °C en 8 min, seguida de 6 min a 160 °C. Después de la mineralización, se agregaron 4 ml de agua ultrapura a los volúmenes de muestra. Las muestras recuperadas se diluyeron adecuadamente para el análisis ICP-MS (Element-2; Thermo-Finnigan, Rodano (MI), Italia).

Las imágenes de resonancia magnética se adquirieron en un escáner 7T Bruker Biospin Pharmascan 70/16 equipado con una bobina de superficie transmisora-receptora 1H/23Na (20 mm de diámetro) (Bruker, Magnetic Resonance Imaging, Milán, Italia) en presencia de una referencia con Na+ conocido. concentración (gel de agarosa al 1% en tampón fosfato Na+, [Na+] = 75 mM).

La bobina de superficie se colocó sobre una cama para ratas y se insertó en el orificio del imán en correspondencia con el centro de la bobina de RF. Los ratones fueron anestesiados con una mezcla detiletamina/zolazepam (Zoletil 100; Vibac, Milán, Italia) 20 mg/kg y xilazina (Rompun; Bayer, Milán, Italia) 5 mg/kg. Los ratones se colocaron en la bobina de superficie con el área del tumor en el medio de la sonda de la bobina de superficie.

Las imágenes ponderadas en protones T2 se recopilaron utilizando una secuencia de pulsos Turbo RARE (FOV 30 × 30, MTX 128 × 128, espesor de corte 3 mm, resolución espacial 0,23 × 0,23 mm2, TE 55 ms, TR 2500 ms, RF 12, promedio 1) .

La secuencia FLASH de gradiente-eco de Na+ se configuró con los siguientes parámetros: FOV 30 × 30, MTX 32 × 32, espesor de corte 3 mm, resolución espacial 0,94 × 0,94 mm2, TE 2,05 ms, TR 50 ms, promedio 548.

En el experimento del primer día, las imágenes de 1H y 23Na se adquirieron antes y 2 h después del tratamiento, que consistió en una dosis de Monensina de 16 mg/Kg en PBS (recién preparada a partir de la solución madre 22 mM en DMSO), o de la solución vehículo equivalente para los grupos tratados y de control, respectivamente. En los días siguientes, las imágenes se adquirieron 2 h después del tratamiento. Al final del experimento, los ratones fueron sacrificados (sin perfusión) y se cuantificó el contenido de Na+ de los tumores recuperados, como se describió anteriormente.

El análisis de las imágenes se realizó mediante el software de imágenes preclínicas Paravision 360 (Bruker). Para cada día del experimento, los valores medios de intensidad de señal (SI) se calcularon en una región de interés (ROI) dibujada manualmente en todo el tumor y se normalizaron utilizando la muestra de referencia. El cambio SI (cambio porcentual) se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: cambio porcentual = [(SIpost – SIpre)]/SIpre × 100 donde pre se refiere a la imagen adquirida antes del inicio del tratamiento y post a la imagen adquirida después de 2 h del tratamiento con Monensin. El cambio porcentual se calculó promediando el cambio porcentual obtenido para los ratones en el grupo control o tratado, respectivamente. El contenido tisular de Na+ milimolar se expresó como mmol por kg de tejido, suponiendo que la densidad del tejido fuera igual a 1 g/ml.

Cada experimento se repitió de forma independiente al menos tres veces. Los resultados se presentan como la media de tres a ocho experimentos independientes ± desviación estándar. La significación estadística entre dos grupos se determinó mediante la prueba t de Student de dos colas no apareada o pareada o la prueba U de Mann-Whitney. Para la comparación de múltiples grupos y en el transcurso del tiempo, se utilizó ANOVA de una vía o ANOVA de dos vías. La normalidad de la distribución de todos los grupos se verificó preliminarmente con la prueba de Kolmogorov y Smirnov. La significancia se estableció en el nivel del 5%. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo (*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001). Para los análisis estadísticos se utilizaron GraphPad Prism v.8.4.3 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.) y OriginPro (Versión 2023. OriginLab Corporation, Northampton, MA, EE. UU.).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

La fuente numérica de todos los datos mostrados en los gráficos se incluye en el archivo de Datos Suplementarios.

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Este trabajo fue apoyado por la Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC, subvenciones IG-2020-24351 a RC) por el Ministerio de Salud italiano (subvención nº RF-2018-12366471 a AF) y por la Fondazione Cariplo (subvención nº 2018-0253 a CB).

Estos autores contribuyeron igualmente: Nausicaa Clemente, Simona Baroni.

Departamento de Ciencias de la Salud Universidad del Piamonte Oriental, Via Solaroli, 17, 28100, Novara, Italia

Nausicaa Clemente, Simone Fiorilla, Francesco Tasso, Chiara Borsotti, Gillian Walker, Antonia Follenzi y Rita Carini

Departamento de Biotecnología Molecular y Ciencias de la Salud, Universidad de Torino, Via Nizza, 52, 10126, Torino, Italia

Simona Baroni, María Rosaria Ruggiero y Simonetta Geninatti Crich

Departamento de Medicina Traslacional, Unidad de Biología Muscular, Universidad del Piamonte Oriental, Via Solaroli, 17, 28100, Novara, Italia

Simone Reano

División de Oncología Experimental/Unidad de Urología, URI, IRCCS, Ospedale San Raffaele, Milán, Italia

Elisa Alchera

Departamento de Ciencias de la Salud y Centro de Investigación Interdisciplinaria de Enfermedades Autoinmunes (IRCAD), Universidad del Piamonte Oriental, Via Solaroli, 17, 28100, Novara, Italia

Marco Corrazzari

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NC realizó los experimentos in vivo y analizó los datos. FT, SF y EA realizaron los experimentos in vitro y analizaron los datos. SR realizó el análisis de respirometría de alta resolución y analizó los datos, mientras que SF realizó análisis confocales, de imágenes in vivo y análisis inmunohistoquímicos. MC contribuyó al análisis de imágenes in vivo mientras CB y GW realizaron los experimentos de hematopoyesis y analizaron los datos. MRR y SB realizaron la adquisición relaxométrica y los análisis ICP-MS y analizaron los datos. SB y SG realizaron estudios de 23Na-MRI y analizaron datos. SG concibió y supervisó los experimentos ICP-MS, RMN relaxométrica y RMN 23Na. SG, AF, CB, GW y SB revisaron y editaron el manuscrito, con SG, AF y RC supervisando el estudio. RC concibió el estudio, proporcionó financiación y escribió el manuscrito.

Correspondencia a Simonetta Geninatti Crich o Rita Carini.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Charles S Springer y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: Joao Valente.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Clemente, N., Baroni, S., Fiorilla, S. et al. El aumento del sodio intracelular mata selectivamente las células de hepatocarcinoma e induce la reducción del tumor del carcinoma hepatocelular en ratones. Común Biol 6, 574 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04946-4

Descargar cita

Recibido: 29 de noviembre de 2022

Aceptado: 16 de mayo de 2023

Publicado: 29 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04946-4

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