Desarrollo de una ciclodextrina ternaria. - Grupo de ciclodextrina nativa de Zhejiang

Biología de las comunicaciones volumen 5, número de artículo: 1234 (2022) Citar este artículo

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El diseño de funcionalidades útiles en antibióticos antiguos clínicamente validados promete proporcionar la solución más económica para la falta global de antibióticos eficaces, que sin duda representa una grave amenaza para la salud. Aquí mostramos que el uso de la química de la superficie del ciclo de la ciclodextrina (βCD) y la arginina (arg) como conector proporciona un complejo antibiótico ternario más estable (βCD-arg-cpx). A diferencia de los complejos de inclusión clásicos menos estables, que sólo modifican la solubilidad de los antibióticos, el complejo ternario aquí presentado es más estable y controla la liberación del fármaco. Los componentes del complejo intensifican las interacciones con las membranas bacterianas y aumentan la disponibilidad del fármaco dentro de las células bacterianas, mejorando así su eficacia antimicrobiana y su perfil de seguridad. Los antibióticos multifuncionales, formulados como sistemas de administración de fármacos per se, que llevan el fármaco al lugar de acción, maximizan su eficacia y proporcionan detectabilidad óptica, se vislumbran como el futuro en la lucha contra las infecciones. Su papel como herramienta contra cepas multirresistentes sigue siendo un desafío interesante abierto a futuras investigaciones.

La disminución de los antimicrobianos eficaces plantea una amenaza muy grave para la salud global en el mundo moderno, como señaló recientemente la Organización Mundial de la Salud1. En las últimas décadas sólo han llegado al mercado unos pocos antibióticos novedosos, y no se ha descubierto ninguna clase de antibióticos completamente nueva desde 19802. Con costos enormes y beneficios impredecibles y a corto plazo, el descubrimiento de nuevos antibióticos no es una prioridad importante para la industria farmacéutica2,3. Reutilizar, redefinir o reutilizar medicamentos clínicamente aprobados tiene importantes ventajas en términos de tiempo y costo respecto al descubrimiento de nuevos fármacos candidatos, especialmente en situaciones emergentes como las pandemias4,5. Los beneficios críticos son un perfil de seguridad predecible, conocimiento previo sobre los procedimientos de fabricación, protocolos de prueba establecidos, requisitos regulatorios más sencillos y períodos de comercialización más cortos, entre muchos otros6,7. Por lo tanto, no sorprende que aproximadamente un tercio de todos los medicamentos aprobados en la última década hayan sido medicamentos antiguos reutilizados, lo que representa el 25% de los ingresos de la industria farmacéutica7,8. Gran parte del esfuerzo en la actual línea de antibióticos preclínicos se centra en modificar los antibióticos antiguos para aumentar su eficacia, particularmente en sinergia con otros fármacos o componentes auxiliares no farmacológicos9,10. Los principales desafíos científicos para lograr esto son la penetración limitada, el flujo de salida y la toxicidad asociados con el tratamiento con dosis altas9,10.

Un enfoque simple y muy eficaz para rediseñar los antibióticos antiguos incluye la formación de complejos inestables que modifican propiedades como la solubilidad, la estabilidad, la biodisponibilidad y la permeabilidad, influyendo así directamente en su resultado terapéutico. En ese contexto, las ciclodextrinas (CD) son particularmente aplicables11,12. Con estructura de cono truncado, tienen una cubierta hidrófila (con 7 grupos primarios orientados hacia el borde estrecho y 14 grupos hidroxilo de azúcar secundarios orientados hacia el borde más ancho del cono, en el caso de la β-CD) y un núcleo hidrófobo (con una columna vertebral de carbono de 7 unidades de glucopiranosa que forman la estructura de β-CD) disponible para interacciones con moléculas de fármacos11,13,14. Más comúnmente, los antibióticos se formulan como complejos de inclusión cuando la parte hidrofóbica del fármaco interactúa con el área hidrofóbica del núcleo interno de la CD, lo que en consecuencia aumenta varias veces su solubilidad11. Este enfoque se ha aplicado a varios antibióticos (β-lactámicos, microlidos, fluoroquinolonas, sulfonamidas, tetraciclinas y aminoglucósidos), y sus concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) se redujeron en factores de 2 a más de 10011. Es un método impulsado por entalpía. proceso, y el complejo huésped-huésped CD-fármaco está en equilibrio con el fármaco libre sin enlaces químicos12. Este enfoque se vuelve aún más eficaz si el excipiente de CD se combina con componentes auxiliares especialmente seleccionados (como polímeros hidrófilos, aminoácidos o ácidos hidroxilo) para formar complejos ternarios15,16,17,18. La parte hidrófoba del fármaco forma un complejo de inclusión CD-fármaco, mientras que la parte hidrófila sufre simultáneamente una reacción ácido-base con el componente auxiliar para formar una sal.

Un buen ejemplo es la arginina, un aminoácido básico que forma sales con fármacos ácidos (p. ej., naproxeno, zoloprofeno, oxaprozina) formando complejos con CD16,17,18. Como resultado, se obtiene un aumento importante en la constante de estabilidad y en la eficacia de la complejación. Por lo tanto, se espera que la combinación de un antibiótico con CD y arginina en un complejo ternario pueda influir fuertemente en su actividad antimicrobiana. Sin embargo, hasta el momento sólo se han realizado unas pocas investigaciones sobre tales complejos, entre las cuales un estudio sobre cefuroxima ha demostrado una solubilidad drásticamente aumentada después de la formación de complejos ternarios con CD y arginina19.

En lugar de los complejos de inclusión menos estables que normalmente se forman para aumentar la solubilidad del fármaco, diseñamos un complejo antibiótico ternario de β-ciclodextrina-arginina-ciprofloxacina (βCD-arg-cpx) más estable, en el que la ciprofloxacina (cpx) se une a la superficie hidrófila de βCD a través de un conector de arginina (arg). Con este enfoque, nuestro objetivo no era simplemente aumentar la solubilidad del fármaco como de costumbre. Aquí, nuestro sistema complejo sintetizado es significativamente más estable para controlar la liberación de antibióticos, permite interacciones mejoradas con la pared y las membranas celulares bacterianas y proporciona una mayor permeabilidad y disponibilidad dentro de las bacterias, mejorando en consecuencia la eficacia del tratamiento antibacteriano. Junto con una mayor eficacia antimicrobiana, se demostró una mejora considerable en el perfil de seguridad.

El complejo βCD-arg-cpx se ensambla en estructuras 3D bien organizadas (Fig. 1a) como varillas de unos pocos micrómetros de largo (Fig. 1b) con estructuras radiales altamente ordenadas compuestas de placas conectadas lateralmente de unas pocas decenas de nanómetros de espesor (Fig. 1c). Una mirada más cercana a las placas individuales y el patrón de difracción de electrones asociado (Fig. 1d) revela su naturaleza monocristalina. Morfológicamente, estos ensamblajes difieren de βCD-cpx, y los complejos βCD-arg se detectaron como partículas no ensambladas de forma irregular (Fig. 1e-g).

Ilustración de la estructura con un núcleo cristalino de arg-cpx y βCD en la superficie (a). Morfología SEM que muestra estructuras largas, alineadas y en forma de varilla del complejo βCD-arg-cpx (b) con bordes afilados y nanogruesos (c). Imagen TEM de mayor aumento de las varillas βCD-arg-cpx (d) y el patrón EDS que muestra su naturaleza cristalina (insertar en (d)). Estructuras TEM que revelan diferencias entre βCD-arg-cpx (e), βCD-cpx (f) y βCD-arg (g).

El mapeo elemental en un complejo βCD-arg-cpx de una sola varilla (Fig. 2a1) detectó elementos C (Fig. 2a2), F (Fig. 2a3), N (Fig. 2a4) y O (Fig. 2a5) distribuidos homogéneamente a lo largo del gran área de un cristal. Se realizó un análisis XPS adicional de la composición de la superficie en la referencia del fármaco cpx, así como en el complejo βCD-arg-cpx antes y después del grabado suave con Ar-ions. Dado que N está presente tanto en el antibiótico como en la arginina (no en CD), mientras que F está presente solo en cpx, la mayor relación N/F en un complejo en comparación con cpx se debió al enlace de arginina. Por otro lado, la disminución de las relaciones C/F y O/F desde la superficie hasta la masa del complejo βCD-arg-cpx confirmó la βCD en la superficie. Como el lado F de cpx no está incluido en la complejación, el máximo a 687,5 eV en el espectro F1 (correspondiente a los enlaces CF)20 permanece sin cambios para los tres sistemas investigados (Fig. 2b2). Por otro lado, N1 (con dos máximos a 401,1 eV y 399,7 eV, correspondientes a enlaces CNC y C-NH20, Fig. 2b4) revela una mayor fracción de aminas principalmente en el complejo y luego en el fármaco libre de cpx, lo que se debe a la unión de arginina. parte. Su aumento se observa en la mayor parte del complejo. El espectro C1s (con máximos en 287 eV, 285,8 eV y 284,8 eV correspondientes a C=O, CN y CC, respectivamente)20 y O1s (con máximos en 533,1 eV y 531,5 eV, correspondientes a CO y (C=O)- OH, respectivamente)20) muestran una disminución de las intensidades de los máximos pertenecientes a los grupos CO y CN en un complejo en comparación con la referencia cpx libre, lo que se debe a su participación en la complejación.

Imagen STEM (a1) con análisis de mapeo elemental correspondiente al carbono (C) (a2), oxígeno (O) (a3), nitrógeno (N) (a4) y flúor (F) (a5); Análisis XPS de la superficie y el volumen (obtenido después de un grabado suave) del complejo βCD-arg-cpx en comparación con la referencia prístina de cpx: espectros de alta resolución C1s (b1), F1s (b2), O1s (b3) y N1s (b4). .

Los conjuntos complejos βCD-arg-cpx de alta relación de aspecto son altamente cristalinos, como lo indican sus agudos máximos de difracción policristalina (Figura complementaria 1a). La estructura cristalina detectada es similar a la del cpx básico desprotonado (como se observa en la referencia 21), con máximos de difracción desplazados y la aparición de nuevos picos. También difiere ligeramente de la estructura detectada para el complejo βCD-NaOH-cpx (una referencia precipitada al reemplazar arg con NaOH) y coincide exactamente con la estructura de arg-cpx (una referencia correspondiente a la sal de ciprofloxacina-arginina) (Fig. 1a), que resulta de la reacción ácido-básica entre cpx y arg, formación de la sal y su cristalización. Por el contrario, la cristalización de los componentes cpx y arg separados dentro de los agregados complejos βCD-cpx y βCD-arg es baja, lo que da baja intensidad y máximos de difracción amplios (Figura complementaria 1a). Debido a la ausencia del ensamblaje, el orden cristalino en estas estructuras disminuye notablemente. Por lo tanto, la parte cristalina de βCD-arg-cpx consistía en una sal de arg-cpx con un componente de βCD amorfo asociado a la superficie del cristal.

Se observaron grandes diferencias estructurales entre los diferentes tipos de complejos, particularmente en sus espectros FTIR (Figura complementaria 1b). El espectro FTIR del complejo de inclusión βCD-arg (Figura complementaria 1b) mostró bandas típicas de βCD con un estiramiento amplio de OH a 3300 cm-1 y una flexión de OH a 1640 cm-1, y un estiramiento de CH a 2925 cm-1, y vibración del anillo. bandas como estiramientos asimétricos de COC y CC a 1152 cm-1, 1026 cm-1 y 932 cm-1 17,22,23, y modos de estiramiento de guanidina CN a partir de arginina a 1554 cm-1 (más detalles en la figura complementaria 2) 24. La intensidad de los modos de estiramiento y flexión del OH de βCD se alteró en el espectro de βCD-arg, pero no se observaron bandas adicionales (Figura complementaria 2). En el complejo βCD-cpx, se observaron ligeros cambios de posición para las bandas correspondientes a las vibraciones de los anillos aromáticos de cpx y βCD obtenidos debido a la incorporación de la molécula dentro del cono de βCD, lo cual es típico de los complejos de inclusión (Figura complementaria 3)25 ,26. Además, la banda vibratoria del carboxilo C=O de cpx a 1708 cm-1 indicó una forma molecular neutra25,26. El complejo βCD-cpx no mostró bandas adicionales (Figura complementaria 3).

Se observó una situación completamente diferente para el complejo βCD-arg-cpx (Figura complementaria 1b). El modo de vibración de estiramiento del carbonilo C=O, detectado a 1708 cm−1 en βCD-cpx y también en la mezcla física de los componentes βCD, arg y cpx, falta en los espectros de ambos complejos, βCD-arg-cpx y βCD-NaOH- cpx, mientras que la vibración asimétrica del carboxilato de los complejos (que faltaba en el caso de la mezcla física y βCD-cpx) aparece en 1578 cm-1, ambas indicando formas de zwitterion cpx dentro de βCD-arg-cpx y βCD-NaOH-cpx (Figs. 3 y S4). A diferencia del espectro del complejo de inclusión βCD-cpx y el espectro de una mezcla física de componentes del complejo, en βCD-arg-cpx faltaba la vibración de estiramiento del OH cpx a 3526 cm−1, otra indicación de su desprotonación. forma dentro del complejo. Además, las bandas vibratorias típicas observadas en complejos anteriores aparecieron en el espectro de βCD-arg-cpx con mayor intensidad, relaciones de intensidad modificadas y mayor resolución, lo que indica un aumento en el orden estructural y la cristalinidad (como se observa en las vibraciones del grupo carbonilo en formulaciones que contienen cpx semicristalino)26. Se detectaron nuevas bandas vibratorias, particularmente en el área de las huellas dactilares (Figura complementaria 4), que no pertenecían a ninguno de los componentes separados del complejo (por separado y en su mezcla física), sino que eran consecuencia de la nueva estructura compleja. Fue interesante observar que la mayoría de las nuevas bandas obtenidas para βCD-arg-cpx también se detectaron en arg-cpx y βCD-NaOH-cpx, ajustados al mismo pH usando arginina o NaOH, lo que además confirmó la estructura similar de complejos formados utilizando estos dos moduladores de la acidez. Sin embargo, la presencia de arginina dentro de βCD-arg-cpx afectó las vibraciones del anillo del ciclo de βCD, observadas como la ausencia de vibraciones típicas de βCD a 1079 y 996 cm-1 y una libertad de vibración adicional detectada a través de la nueva banda a 1178 cm-1. , que no se detectó en βCD-NaOH-cpx. Estas nuevas interacciones dentro de βCD-arg-cpx podrían ser una fuente de una mejor estabilidad compleja, que se mostrará más adelante. Las investigaciones de las propiedades ópticas de los complejos βCD permitieron conocer mejor sus características estructurales. Los espectros de emisión de fluorescencia de los complejos βCD-arg-cpx y arg-cpx (Fig. 1c complementaria) mostraron un cambio batocrómico cuando el componente βCD se unió a la sal arg-cpx. Se observó un cambio en ambos casos cuando βCD se unió al complejo βCD-arg-cpx o βCD-NaOH-cpx (Figura complementaria 1c). Indirectamente, esta observación confirmó la presencia de este componente amorfo encima de cristales de cpx desprotonados (detectados en XRD y revelados en FTIR) y proporcionó evidencia de la posición de enlace. La fluorescencia observada se asignó a la molécula del antibiótico, con grupos donadores de electrones piperazinilo y aceptores de electrones del ácido 4-oxoquinolin-3-carboxílico27. De manera similar, en el presente caso, cpx está unido mediante arg a βCD mediante un grupo piperazinilo con naturaleza donante de electrones. La unión de la molécula cpx sobre el conector de arginina a βCD (o directamente a la molécula de βCD) limita sus movimientos intramoleculares y elimina las relajaciones no radiantes, lo que permite que la fluorescencia en λmax se desplace en comparación con la forma libre del fármaco.

Monitorear el pH y el potencial zeta y reemplazar arg con NaOH como modificador de pH reveló pasos críticos hacia la formación de complejos (Fig. 3). Inicialmente, la mezcla de reacción tenía un pH de 7,5, en el que βCD tiene grupos OH disponibles, arg está en forma de zwitterión con una carga catiónica en guanidina y grupos carboxilo desprotonados, y cpx tiene una amina catiónica en piperazinilo y grupos carboxilo desprotonados (como se ilustra en la Fig. .3a). La formación del complejo βCD-arg-Cpx comienza con una reacción de base ácida en la que los grupos carboxilo en arg interactúan con la amina catiónica en el lado piperazinil cpx, formando una sal de arg-cpx (Fig. 3b). La etapa de cristalización por precipitación permite la formación de estructuras de varillas largas. La superficie de los cristales formados tiene grupos guanidina libres disponibles para unir componentes amorfos de βCD y ensamblar el complejo CD-arg-Cpx final (Fig. 3b). Las aminas en el grupo funcional guanidina de la arginina tienen una afinidad muy alta por los enlaces de hidrógeno, con la posibilidad de formar hasta cinco enlaces que involucran aminas tanto protonadas como no protonadas28. Por lo tanto, en el complejo formado, la arginina tiene el papel de un conector, que utiliza grupos guanidina catiónicos para unir βCD a la superficie y grupos carboxilo iónicos para unir cpx. El potencial zeta de βCD (inicialmente a pH = 6) cambia después de agregar arginina (Tabla en la Fig. 3), lo que indica interacciones entre los grupos catiónicos de guanidina principal y los grupos OH en el lado externo hidrófilo de βCD.

Estructuras moleculares de la mezcla precursora antes de la precipitación (pH 7,5), cambio de potencial zeta para diferentes componentes complejos y precipitación después de 2 h de mezcla en el caso del ajuste del pH con arginina (y su retraso cuando se reemplaza arg con NaOH (βCD-NaOH- cpx)) (a). Precipitación (pH 6,5) que implica la formación de sal arg-cpx y enlace βCD seguido de cristalización y ensamblaje (b).

La estructura del complejo CD-arg-cpx formada aparece como un precipitado de color blanco ópalo brillante dos horas después de mezclar todos los componentes. Cuando βCD se mezcla directamente con cpx sin agregar arginina, la solución permanece clara sin precipitación. La medición del potencial zeta del polvo liofilizado da valores neutros correspondientes a agregados complejos inestables de βCD-cpx. Como se observó anteriormente, el complejo de inclusión βCD-cpx se forma mediante la incorporación de un resto hidrofóbico de ácido 4-oxoquinolina-3-carboxílico de la molécula cpx dentro del cono hidrofóbico de βCD29. Cuando se ajustó la acidez de la mezcla de reacción inicial usando NaOH (en lugar de arginina), la precipitación de βCD-NaOH-cpx como un complejo libre de arg fue mucho más lenta y no tuvo lugar después de dos horas de mezcla, como en el caso de βCD-arg-cpx (ilustrado en las fotos de la Fig. 3a), pero se retrasó durante las siguientes 24 h. βCD-NaOH-cpx es un complejo βCD-cpx ajustado al pH y carece de la estabilidad observada para βCD-arg-cpx.

Los conjuntos βCD-arg-cpx emitieron una intensa luz fluorescente azul que apareció junto con sus estructuras en forma de varilla (Fig. 4a). También se observó una fluorescencia similar para βCD-cpx (siguiendo la estructura de forma irregular del agregado complejo) (Fig. 4b), pero no para βCD-arg (que también forma agregados irregulares) (Fig. 4c). Se ha observado previamente que los derivados de ciprofloxacina, en forma de nanoagregados esféricos que contienen anillos de perfluoroarilo y fenilo unidos por enlaces de amidina al grupo piperazinilo de la ciprofloxacina, muestran emisión inducida por agregación (AIE)27. Sin embargo, hasta donde sabemos, la AIE en complejos de ciprofloxacina que contienen βCD no se ha detectado antes.

Fluorescencia azul de complejos que contienen cpx (βCD-arg-cpx y βCD-cpx) (no detectada para βCD-arg) (a). Los espectros de fluorescencia de βCD-arg-cpx y cpx libre (y el complejo βCD-cpx comparable) antes y después de disolverse en agua confirman diferentes mecanismos de disolución (complejo disuelto versus fármaco libre disuelto) (b). Detección de βCD-arg-cpx y de bacterias (100 μg/ml del complejo después de 10 min de exposición a P. aeruginosa PAO1 teñida con yoduro de propidio (PI, fluorescencia roja, detección de bacterias muertas) (c).

También se observaron diferencias en los espectros fluorescentes de los complejos βCD-arg-cpx y βCD-cpx, particularmente antes y después de disolverse en agua (Fig. 4b). En polvos sólidos, los espectros de fluorescencia de βCD-arg-cpx y cpx libre no fueron los mismos, revelando un desplazamiento hacia el azul en el espectro de la estructura complejada con arginina. Cuando se disolvió en agua, el espectro de βCD-arg-cpx permaneció igual que el de la forma compleja sólida, mientras que los espectros del fármaco libre y del complejo de inclusión βCD-cpx menos estable se desplazaron al rojo con exactamente la misma forma de fluorescencia. máximo. Un análisis más detallado de los componentes disueltos en agua reveló cpx libre (y sus dímeros y trímeros identificados en los espectros de MS, figura complementaria 5a), mientras que en el caso de βCD-arg-Cpx, durante el envejecimiento en un ambiente acuoso, el complejo liberó cpx libre. cpx-arg, arg y βCD (Figura complementaria 5b).

La fluorescencia azul intensa proporciona a βCD-arg-cpx una funcionalidad de detección adicional. Después de una breve exposición al complejo βCD-arg-cpx, la viabilidad de las bacterias se vio fuertemente afectada, como se detectó por la fluorescencia roja del yoduro de propidio en una alta fracción de células, que representan bacterias muertas. También pudimos detectar fluorescencia azul de los conjuntos en forma de varilla de βCD-arg-cpx, que liberaron el complejo con una fuerte actividad antimicrobiana (Fig. 4c).

Incluso en un contexto cuantitativo, βCD-arg-cpx difería del complejo clásico βCD-cpx (Fig. 5a). Según lo determinado a partir de los espectros UV-vis de los cpx restantes en la solución después de la formación del complejo, βCD-arg-cpx contenía tres veces el contenido de cpx de βCD-cpx sin arginina. La presencia de arginina y su papel en la formación de complejos afectó el contenido de fármaco dentro del complejo. Se observó una diferencia de 1,5 veces en el contenido de cpx para βCD-cpx y βCD-NaOH-cpx (Fig. 5b), lo que muestra que una diferencia en el pH afectó el contenido del fármaco incluido en el complejo. Sin embargo, en el caso de βCD-arg-cpx, el efecto no se debió únicamente a la contribución del pH durante la formación del complejo, ya que el uso de arginina para modificar el pH al mismo nivel que para NaOH dentro del complejo βCD-NaOH-cpx resultó en un contenido de cpx dos veces mayor en βCD-arg-cpx.

Cpx en sobrenadantes obtenidos después de la síntesis compleja (y contenidos calculados de cpx en complejos βCD) (fármaco liberado del complejo CD-arg-Cpx indicado en azul, del complejo CD-NaOH-Cpx en naranja y de CD-Cpx en negro) (a ) y cinética de liberación de fármacos comparativa de βCD-cpx (negro), βCD-arg-cpx (gris oscuro) y βCD-NaOH-cpx (gris iluminado) (b); norte = 3; las barras de error se refieren a la DE de liberación del fármaco.

Además de su contribución a la formación, ensamblaje y contenido del fármaco incorporado, la arginina afectó la liberación del fármaco del complejo. En un complejo de inclusión clásico βCD-cpx, un equilibrio dinámico menos estable entre el fármaco y el cono hidrófobo de βCD, la liberación de cpx es rápida (Fig. 5b). Después de la incubación a 37 °C en tampón PBS, más del 60% del fármaco se liberó después de 10 minutos de incubación. La descomposición completa del complejo y la liberación de todos los cpx incorporados tuvo lugar en las primeras 24 h. La cinética de liberación fue ligeramente más lenta en el caso de βCD-NaOH-cpx (Fig. 5b): la liberación inicial fue de aproximadamente el 40%, y al final de las 24 h, el complejo liberó hasta el 70% del fármaco incorporado.

En los sistemas de administración de fármacos (como esferas poliméricas encapsuladas), la liberación del fármaco depende de las propiedades del portador del fármaco (es decir, degradación de la matriz polimérica, hinchamiento, respuesta dependiente de T/pH) que permite la liberación física o la desorción del fármaco atrapado. En el caso actual, el fármaco, como parte del complejo, forma parte del sistema de administración del fármaco y su liberación depende de la estabilidad y solubilidad del complejo. Debido a la diferencia en el ensamblaje, el complejo βCD-arg-cpx fue más estable que el complejo de inclusión de βCD-cpx y el complejo βCD-NaOH-cpx con pH modificado, mostrando la liberación más lenta (Fig. 5b). Se sabe que el autoensamblaje de las CD naturales y los complejos farmacológicos afecta su solubilidad12. Inicialmente, este complejo liberaba sólo el 20% del fármaco incorporado, y la liberación continuó lentamente, liberándose hasta el 30% del fármaco después de 24 h. La aplicación de βCD como excipiente o la aplicación de arginina para crear una sal farmacológica dentro de complejos βCD-fármaco es una forma conveniente de mejorar la solubilidad del fármaco. Por el contrario, el nuevo complejo βCD-arg-cpx se desmonta lentamente, disminuye la disolución del fármaco y permite controlar su liberación. La contribución observada a la solubilidad del fármaco es consecuencia de la diferente unión del fármaco a los otros dos componentes (como se ilustra en la Fig. 3). En lugar de incorporar la parte hidrófoba del fármaco dentro del cono de βCD y unir la arginina a su parte hidrófila, que generalmente permanece fuera del cono de βCD, el fármaco se une a la superficie de βCD mediante un conector de arginina, lo que hace que toda la estructura sea más estable contra disolución. Además, las fuerzas que mantienen unidos los conjuntos largos en forma de varilla de βCD-arg-cpx también contribuyen a un desmontaje más lento y proporcionan control de liberación. A diferencia de todas las plataformas asociadas a CD disponibles que se utilizan para modificar antibióticos, hasta donde sabemos, no se ha conferido antes la posibilidad de usar arginina para crear un sistema de administración de antibióticos de liberación lenta a partir de βCD.

Habiendo observado la solubilidad disminuida no convencional y la liberación más lenta de antibióticos del conjunto βCD-arg-cpx, investigamos a continuación el efecto del complejo en las pruebas de eficacia y toxicidad antimicrobiana. En primer lugar, se investigaron la susceptibilidad y las concentraciones inhibidoras mínimas (CMI) de los complejos βCD-arg-cpx y βCD-cpx y sus componentes precursores, βCD, βCD-arg y cpx, frente a varias cepas bacterianas, incluida E. coli gramnegativa. MG1655 (ATCC 47076) y P. aeruginosa PAO1 (ATCC 15692) y S. aureus Rosenbach grampositivo (ATCC 12600), como se resume en la Tabla 1. Ninguna de las cepas bacterianas investigadas mostró susceptibilidad a βCD o βCD-arg. Para βCD-cpx, encontramos valores de CIM de 0,056 μM para E. coli y 0,21 μM para P. aeruginosa y S. aureus (Tabla 1). Si tenemos en cuenta el contenido de cpx del 19% en peso en βCD-cpx y hasta el 70% de liberación de fármaco durante una incubación de 24 h a 37 ° C (Fig. 5b), las CIM corresponden a 0,0074 μM y 0,028 μM de fármaco libre. equivalentes. En relación con la referencia cpx, el complejo de inclusión βCD-cpx proporcionó aumentos de aproximadamente 28 veces en la actividad antimicrobiana para todas las cepas bacterianas analizadas. La eficacia antibacteriana de βCD-arg-cpx fue mayor que la de los demás con CIM de 0,0045 μM para E. coli, 0,018 μM para P. aeruginosa y 0,060 μM para S. aureus. Con un contenido de cpx del 58% en peso y hasta un 30% de liberación de fármaco (Fig. 5b), la CIM fue igual a equivalentes de cpx libres de 0,0008 μM, 0,003 μM y 0,010 μM, respectivamente. En consecuencia, en comparación con la referencia cpx, βCD-arg-cpx tenía una actividad antimicrobiana 260 veces, 260 veces y 78 veces mayor para las cepas bacterianas analizadas, respectivamente.

La citotoxicidad en células de mamíferos se evaluó utilizando células epiteliales de pulmón (A549) (Tabla 1 y Fig. 6a). El complejo βCD-arg-cpx se caracterizó como no tóxico (con un alto valor de CC50 de 2000 µg/ml (1220 µM)). Solo las dosis de alta concentración (> 1000 μg / ml (610 μM)) de βCD-arg-cpx mostraron una reducción dependiente de la dosis en la viabilidad celular (Fig. 6b), que correspondió a aproximadamente 100.000 a 800.000 veces más CMI. La complejación de cpx con βCD disminuye la toxicidad (Tabla 1). Además, es importante señalar que el índice de selectividad (IS) aumentó en las diferentes pruebas bacterianas en comparación con el de cpx soluble (13 veces para E. coli, 17 veces para P. aeruginosa y 42 veces para S. aureus) ( Tabla 1). En otras palabras, si bien las concentraciones nanomolares exhibieron una actividad antimicrobiana eficiente, se necesitaron concentraciones milimolares para los efectos tóxicos, lo que presentó una ventana terapéutica extensa para la aplicación segura del complejo y aumentó la posible eficacia in vivo en comparación con el cpx comercial soluble.

Citotoxicidad de βCD-arg-cpx y sus componentes para las células epiteliales pulmonares A549 (a). El gráfico muestra el porcentaje de viabilidad de las células A549 después de la incubación con diferentes concentraciones de complejos de βCD (0 mg/ml (negro), 0,5 mg/ml (con patrón), 1 mg/ml (gris claro), 1,5 mg/ml (gris oscuro). ) y 2 mg/ml (borde negro). Se usó DMSO como control positivo para la toxicidad, mientras que monocapas de A549 sin tratar se usaron como control negativo para la citotoxicidad; n = 3; las barras de error se refieren a la DE de viabilidad en relación con las no tratadas Comparación del crecimiento de P. aeruginosa PAO1 (blanco) en presencia de βCD-arg-cpx (0,03 μg/ml o 0,020 μM) (púrpura), βCD-NaOH-cpx (0,2 μg/ml o 0,132 μM) (verde ), βCD-cpx (0,2 μg/ml o 0,140 μM) (azul), βCD-arg (0,03 μg/ml o 0,0023 μM) (naranja) y βCD (0,03 μg/ml o 0,0026 μM) (rosa) (b) ; n = 3; las barras de error se refieren a la densidad óptica SD.

Luego investigamos la actividad antimicrobiana analizando los valores de CIM y la cinética del crecimiento bacteriano, como se presenta en la Fig. 6b para el caso de P. aeruginosa. En la figura complementaria 6 se presentan más detalles sobre la prueba de microdilución realizada para los complejos βCD-arg-cpx y βCD-cpx, CD-arg y componentes auxiliares de CD, así como la comparación directa del fármaco βCD-arg-cpx con el fármaco cpx libre. Los componentes complejos, βCD y βCD-arg no alteraron el crecimiento bacteriano. Por otro lado, a 0,2 μg/ml, tanto βCD-cpx como βCD-NaOH-cpx (como versión de βCD-cpx obtenida en medio alcalino) (con concentraciones molares de 0,140 μM y 0,132 μM, respectivamente) desaceleraron el crecimiento bacteriano con un efecto bacteriostático claro. efectos, mientras que βCD-arg-cpx permitió efectos bactericidas a 0,03 μg/ml (0,018 μM). Estos resultados proporcionaron evidencia clara de que la mejora en la actividad antimicrobiana de βCD-arg-cpx no es consecuencia del pH al que se forma el complejo (aunque βCD-NaOH y βCD-arg-cpx tienen estructuras similares). Además, refleja directamente el papel especial de la arginina como conector. La disminución de la CIM entre el clásico complejo de inclusión βCD-cpx menos estable y el ensamblaje βCD-arg-cpx más estable puede ser una consecuencia de cómo se liberan y desensamblan. Debido a las débiles interacciones entre los antibióticos y la βCD en el complejo de inclusión, cuando se disuelven, el complejo se descompone, permitiendo la liberación del fármaco libre. Por otro lado, cuando la arginina conecta βCD y cpx, las fuerzas de unión son más fuertes y el desmontaje de las estructuras en forma de varilla da como resultado una liberación gradual de cpx libre y también de cpx-arg como forma de fármaco más activa.

En un contexto morfológico, después del tratamiento con cpx y βCD-arg-cpx de bacterias gramnegativas (E. coli y P. aeruginosa), observamos filamentación bacteriana (Figs. 7 y 8, respectivamente). Esto fue una evidencia de que el mecanismo antibacteriano primario de cpx no cambió, y también se observó cuando el fármaco estaba dentro del conjunto del complejo βCD-arg-cpx. Se sabe que Cpx afecta la replicación del ADN al atacar la ADN girasa, que inhibe la división celular bacteriana30,31. Bajo estrés inducido por antibióticos, las bacterias que detienen la división celular continúan su crecimiento inhibiendo la septación celular, aumentando su longitud y formando filamentos largos32. Dependiendo de las condiciones de estrés, las bacterias dentro de los filamentos pueden sobrevivir o morir30. Si las unidades celulares individuales conectadas dentro de un filamento permanecen viables y forman largas cadenas multicelulares, se produce un alivio del estrés en la cepa resistente a los antibióticos en evolución31. En ese contexto, las concentraciones subinhibitorias de cpx inducen la filamentación de bacterias con forma de bastón como un paso de transición hacia su evolución hacia cepas resistentes a cpx32. Después del tratamiento con concentraciones subinhibitorias de cpx muy bajas, 0,003 μg/ml (0,008 μM) en E. coli y 0,03 μg/ml (0,08 μM) en P. aeruginosa, observamos una filamentación muy intensa y larga en E. coli (Fig. 7b, e, h) (compárese con la referencia no tratada (Fig. 7a, d, g), mientras que P. aeruginosa mostró solo elongación celular con pocos casos de filamentos muy largos (Fig. 8b, e, h) (que fue no detectado en referencia (Fig. 8a, d, g)). Los tabiques de división conectados, observados en imágenes SEM, resultaron de la inhibición bacteriana de la división celular. Solo algunas células filamentosas estaban muertas, como lo revela la tinción viva/muerta, mientras que la mayoría permaneció viva y sobrevivió al estrés inducido por la baja concentración de cpx (Figs. 7e, 8e). La membrana celular bacteriana permaneció intacta (como se muestra al teñir con FM464 solo en la superficie) y mostró claramente varios nucleosomas a lo largo de los filamentos (teñidos con DAPI) (Fig. 7h, 8h). También observamos bacterias de tamaño normal conectadas a los extremos de los filamentos (Fig. 7h), lo que indica depuración y la posible formación de cepas resistentes a los antibióticos.

Morfología y superficie de las células de E. coli antes (a) y después de la exposición a una concentración baja de cpx (0,003 μg/ml o 0,008 μM) (b) y equivalente de cpx en βCD-arg-cpx (0,003 μg/ml o 0,002 μM) (C); E. coli viva teñida con colorantes vivos/muertos (d) y fracción de células viables de E. coli tratadas con 0,003 μg/ml (0,008 μM) cpx (e) y βCD-arg-cpx (0,002 μM) (f). Estructura de membrana de E. coli de tipo salvaje teñida con colorantes FM464/DAPI (g) y bacterias tratadas con 0,003 μg/ml de cpx puro (0,008 μM) (h) y complejo CD-arg-cpx (0,002 μM) (i).

Morfología y superficie de las células PAO1 antes (a) y después de la exposición a una concentración baja de cpx (0,03 μg/ml o 0,08 μM) (b) y cpx equivalente en βCD-arg-cpx (0,03 μg/ml o 0,02 μM) (c) . P. aeruginosa PAO1 viva teñida con colorantes vivos/muertos (d) y fracción de células viables tratadas con 0,03 μg/ml de cpx (0,08 μM) (e) y βCD-arg-cpx (0,02 μM) (f). Estructura de membrana de P. aeruginosa PAO1 de tipo salvaje teñida con colorantes FM464/DAPI (g) y bacterias tratadas con 0,03 μg/ml de cpx puro (0,08 μM) (h) y complejo βCD-arg-cpx (0,02 μM) (i) .

Se observó una situación completamente diferente cuando se trató con las mismas concentraciones del complejo βCD-arg-cpx utilizadas para cpx soluble (Figs. 7, 8). En E. coli, una concentración de cpx muy baja (0,003 μg/ml (0,002 μM) del complejo βCD-arg-cpx detuvo eficazmente el crecimiento bacteriano y disminuyó el número de células filamentosas (Fig. 7c). Los filamentos contenían membranas celulares intactas y entidades multinucleosomas (Fig. 7i). Lo más importante es que se confirmó que todas las bacterias detectadas, de tamaño normal y filamentosas, estaban muertas (Fig. 7f). Se obtuvo un resultado similar para P. aeruginosa expuesta a una concentración baja de cpx. (0,03 μg/ml (0,02 μM)) del complejo βCD-arg-cpx. Aunque el número de filamentos formados aumentó, una mirada más cercana a su superficie reveló un fuerte daño, mientras que su entorno mostró muchos fragmentos celulares que quedaron después de la descomposición (Fig. 8c) Se detectó una descomposición similar de P. aeruginosa después de la exposición a una dosis alta de cpx (0,2 μg/ml (0,52 μM), lo que resultó en una mayor formación de vesículas de membrana inducida por un mecanismo explosivo de lisis celular30. Como se observó en E. coli, todos los P. aeruginosa filamentosos estaban muertos (Fig. 8f). FM646/DAPI reveló su estructura multinuclear y la deformación de la membrana en vesículas (Fig. 8i). La deformación de la membrana, la formación de vesículas y el daño celular por lisis celular explosiva fueron progresivos y dependieron de la concentración del complejo βCD-arg-cpx (Figura complementaria 7). En concentraciones más bajas (0,03 μg/ml (0,02 μM), se detectaron tanto filamentos como células de tamaño normal. Todas tenían paredes celulares dañadas que contenían pequeños agujeros y estaban parcialmente descompuestas en vesículas (200 nm de tamaño). A concentraciones más altas de βCD- concentración de arg-cpx (0,1 μg/ml (0,06 μM)), ya no se detectaron filamentos y todas las células restantes de tamaño normal se lisaron completamente en fragmentos de pared celular similares a vesículas de aproximadamente 100 nm de tamaño. Se indicó daño celular progresivo. su respuesta al estrés creciente inducido por el cpx cargado en el complejo. Cambios similares que incluyen deformaciones intensas en la membrana, daño a la estructura de las células y, finalmente, actividad antimicrobiana cuando el complejo βCD-arg-cpx se usó en concentraciones mucho más bajas. También se observaron concentraciones superiores al fármaco cpx libre para S. aureus, una cepa grampositiva (Figura complementaria 8).

La toxicidad y eficacia in vivo del complejo βCD-arg-cpx se investigaron en gusanos Galleria mellonella (Fig. 9) como modelo animal previamente optimizado para evaluar la eficacia antibacteriana y la toxicología33,34. Se investigó la toxicidad a altas concentraciones del complejo (hasta 2421 mg/kg) y se observó una supervivencia del 100% para todas las concentraciones investigadas. Para el estudio de eficacia antibacteriana, los gusanos fueron preinfectados con P. aeruginosa PAO135. Sin ningún tratamiento se obtuvo el 100% de muerte a las 24 h. El tratamiento posinfección con βCD-arg-cpx en concentraciones de 5 mg/kg (3,3 mM) y 10 mg/kg (6,6 M) dio como resultado una supervivencia del 100%. Como referencia, el tratamiento con 5 mg/ml (13,3 mM) de cpx libre dio como resultado sólo un 20 % de supervivencia. La mejor eficacia del tratamiento con el complejo βCD-arg-cpx en comparación con el fármaco libre se ve respaldada por el hecho de que el complejo contiene solo 58% en peso de cpx, que se libera lentamente de las estructuras ensambladas (como se muestra en la Fig. 5). .

La toxicidad del complejo βCD-arg-cpx muestra una supervivencia larvaria muy alta en todo el rango de concentraciones probado (hasta 2421 mg/kg) (a). Estudio comparativo de eficacia antibacteriana en larvas infectadas con PAO1 (azul oscuro) y tratadas con el complejo βCD-arg-cpx (verde claro y marrón) y fármaco cpx libre (verde oscuro y morado) (contenido de cpx equivalente a 5 y 10 mg cpx/ kg de larva, respectivamente) que muestra una mayor supervivencia de los gusanos preinfectados después del tratamiento con el complejo (b). Asteriscos: diferencias estadísticamente significativas versus control de P. aeruginosa PAO1 en una prueba de rango logarítmico (**valor de p < 0,01); n = 5. Esta figura representa el mismo experimento repetido varias veces, que arrojó resultados idénticos cada vez.

El mecanismo subyacente básico de la acción antimicrobiana en el fármaco complejado βCD-arg-cpx sigue siendo el mismo que el de su fármaco en forma libre. El complejo βCD-arg-cpx tiene la misma capacidad para inhibir el progreso de la división celular que normalmente se obtiene con cpx libre, así como para inducir cambios similares relacionados con el estrés en las bacterias, como la filamentación y la lisis explosiva impulsadas por la formación de vesículas de membrana. Aunque estas dos formas de fármaco utilizan el mismo mecanismo de acción, es evidente una diferencia en su eficacia y podría atribuirse a una diferencia en su biodisponibilidad. La presencia del componente βCD, con la conocida capacidad de aumentar las interacciones con los componentes de la pared celular12, ciertamente promueve la transferencia de fármacos a través de las membranas y, en consecuencia, aumenta la eficacia antimicrobiana en las concentraciones disponibles dentro de la célula bacteriana. Sin embargo, como se ha observado después de una comparación directa de la inclusión de βCD-arg menos estable y complejos de βCD-arg-cpx más estables, el efecto no puede atribuirse únicamente a la presencia de βCD. Debido a la naturaleza reversible de los enlaces en los complejos de inclusión, la solubilización proporciona la forma del fármaco libre en equilibrio con las moléculas de βCD. Este tipo de equilibrio mejora la transferencia de fármacos a través de la membrana, pero es mucho menos eficaz como forma más estable del complejo βCD-arg-cpx. La βCD-arg-cpx más estable, en la que βCD y cpx están unidas mediante un conector de arginina, permite que la βCD actúe como componente de construcción de la molécula del fármaco. Junto con la βCD, la transferencia del fármaco a través de la membrana también se ve afectada por la presencia de arginina y su unión a la molécula del fármaco.

En consecuencia, el cpx complejado se transfirió de manera más efectiva a su objetivo (ADN girasa) y pudo inducir el mismo nivel de estrés que concentraciones mucho más altas de cpx libre. Si las concentraciones del complejo eran lo suficientemente altas (aún mucho más bajas que las concentraciones efectivas del fármaco libre), las interacciones de βCD y arginina unidas al fármaco con los componentes de la pared bacteriana fueron suficientes para desintegrar la estructura celular bacteriana e inducir un proceso de lisis explosivo. Todos estos hechos indican que el estrés inducido a concentraciones muy bajas de βCD-arg-cpx permite una mejora importante de la actividad antimicrobiana. Las investigaciones detalladas sobre el potencial de la forma farmacológica compleja para prevenir procesos evolutivos adaptativos que producen cepas resistentes siguen siendo un desafío interesante para el futuro.

Este tipo innovador de complejos de βCD, en los que se utilizan conectores para establecer conexiones más estables entre la βCD y un fármaco, tiene potencial para mejorar la eficacia de antibióticos previamente aprobados y utilizados clínicamente. Producidos utilizando una química muy simple, tecnológicamente no exigente y altamente económica, estos complejos podrían ser herramientas muy prometedoras para reutilizar, reperfilar o reutilizar diferentes medicamentos. Las investigaciones futuras en esta área deberían centrarse en explorar todas las posibilidades disponibles que se introducen al mejorar la biodisponibilidad de los fármacos dentro de este tipo de complejo, incluida su capacidad para desarrollar y afectar cepas resistentes a los antibióticos, mitigar la toxicidad de los fármacos y mejorar la biocompatibilidad. Dichos complejos pueden ofrecer opciones adicionales en la línea de antibióticos y alentar a la industria farmacéutica a explorar formas más efectivas de antibióticos antiguos y a participar activamente en la resolución de la falta global de antibióticos efectivos como un problema de salud persistente y muy grave en la era moderna.

El complejo se formó utilizando L-arginina (arg, ácido L-2-amino-5-guanidinopentanoico, C16H14N4O2, Sigma–Aldrich, Alemania), clorhidrato de ciprofloxacina (cpx, Cayman Chemical Company) y β-ciclodextrina (βCD, Sigma– Aldrich C4805, Alemania). Todos los productos químicos y reactivos utilizados fueron de grado analítico. Todos los experimentos se realizaron utilizando agua ultradestilada producida en laboratorio.

Antes de formar el complejo, se disolvieron arginina (50 ml, 0,4 mg/ml) y ciclodextrina (50 ml, 2 mg/ml) en agua con agitación continua (200 rpm) durante 15 h a temperatura ambiente. Las soluciones premezcladas se añadieron a una solución acuosa de ciprofloxacina (0,8 mg/ml) y se continuó la agitación (200 rpm) durante las siguientes 24 h. El precipitado blanco apareció 2 h después de la adición de ciprofloxacina. Después de 24 h de mezcla, el sobrenadante se separó por centrifugación (8000 rpm) y el precipitado se redispersó en 5 ml de agua destilada. La dispersión se congeló en hielo seco (durante 3 h) y se liofilizó (24 h, Christ Alpha 1–4, Martin Christ). Se formaron muestras de control siguiendo el mismo protocolo pero con sustitución de arginina por una solución acuosa de NaOH para formar βCD-NaOH-cpx y con sustitución de arginina por agua destilada para formar βCD-cpx. Debido a la falta de precipitación en las muestras de control, el volumen total de la mezcla se congeló y liofilizó. Todos los polvos se guardaron en recipientes de vidrio tapados y se almacenaron en condiciones ambientales para realizar pruebas adicionales.

Los análisis de difracción de rayos X en polvo (pXRD) se realizaron en el rango de 2 a 70 ° 2Θ con un tamaño de paso de 0,02 ° y un registro de 2 s por paso utilizando un difractómetro Bruker AXS D4 Endeavor. Las investigaciones espectroscópicas infrarrojas por transformada de Fourier (FTIR) se realizaron mediante un espectrofotómetro Perkin Elmer Spectrum 400 MIR utilizando la técnica DRIFT. Los espectros se registraron en polvos obtenidos mezclando 5 mg de muestras con 80 mg de KBr. La espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS) se realizó con el Versaprobe 3 AD (Phi, Chanhassen, EE. UU.) utilizando una fuente de rayos X monocromática Al-Kα. Para cada medición, los espectros se adquirieron en un tamaño de punto de 200 µm con el neutralizador de carga encendido, mientras los gránulos se colocaban en una cinta doble no conductora. Los espectros de estudio se midieron con una energía de paso de 280 eV y un paso de 1 eV, mientras que los espectros de alta resolución se midieron con una energía de paso de 27 eV y un paso de 0,025 eV. Se utilizó la neutralización de carga, por lo que la escala de energía de los espectros XPS se corrigió cambiando el pico de carbono de C1 a una energía de enlace de 284,8 eV. Los datos XPS se analizaron con el software PHI Multipak. Para eliminar la capa superficial del sedimento y examinar la superficie subyacente, se utilizó pulverización catódica de la muestra con grupos de argón. La muestra se farfulló durante 1 min a 5 kV y 20 nA en un área de 2 × 2 mm, seguido de un análisis puntual de alta resolución de 200 µm. Los productos de disolución se identificaron mediante espectrometría de masas. Las mediciones se realizaron utilizando un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de aceleración ortogonal híbrido Q-Tof PremierTM (Waters-Micromass, Manchester, Reino Unido) equipado con fuentes de ionización a presión atmosférica (API) y acoplado con un cromatógrafo líquido de ultra rendimiento (TOF MS/ UpLC). La detección se realizó mediante una fuente de ionización por electropulverización (ESI) en modo positivo. Para la microscopía electrónica de barrido morfológico (SEM, Nova NanoSEM), los polvos se dispersaron en agua y se depositaron en membranas de filtro de 50 nm pegadas a una cinta de carbono y recubiertas con carbono de 5 nm. Se realizaron análisis de microscopía electrónica de transmisión estructural (TEM, Tecnai Spirit 120 kV) en muestras dispersas en agua y depositadas sobre rejillas de cobre. Las imágenes STEM se tomaron con un microscopio electrónico de barrido (SEM) Verios 4 G HP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) en modo STEM. Para el mapeo de EDS se utilizó un sistema de espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDXS) con detector Ultim Max 65 y software AZtec (Oxford Instruments Abingdon, Reino Unido). Las imágenes de fluorescencia se realizaron en polvos dispersos en agua que se dejaron caer sobre portaobjetos de microscopio utilizando un microscopio de fluorescencia invertida Nikon ECLIPSE Ti-S/L100 (Nikon) acoplado con una cámara Nikon DS-Qi2. Los potenciales Zeta se midieron utilizando un Mavern Nanosizer.

Las pruebas antibacterianas se realizaron utilizando Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), Pseudomonas aeruginosa PAO1 (ATCC 15692) y Staphylococcus aureus Rosenbach (ATCC 12600). Las cepas se cultivaron durante la noche a 37 °C en medio de crecimiento líquido (Luria Bertani, LB) (Scharlab, España) para E. coli y P. aeruginosa y caldo de soja tríptico (TSB) (Scharlab, España) para S. aureus. Las muestras bacterianas se dispersaron ultrasónicamente en medio de crecimiento durante 30 s (A = 18%, W = 250 W, encendido: apagado = 2:1 s) para formar reservas de 2 mg/ml, que se diluyeron aún más hasta las concentraciones probadas. Se inocularon pocillos de placas de microtitulación (placa de ensayo de 96 pocillos, poliestireno tratado con cultivo de tejidos; Costar 3595, Corning Inc., Corning, NY) con 100 µl de bacterias (OD550 = 0,05) y 100 µl de las diluciones en serie específicas de las bacterias analizadas. muestras. Los controles incluyeron medio de crecimiento y bacterias sin tratamiento. La incubación se realizó en un lector de microplacas multimodo Infinite M200 Pro (Tecan) a 37 °C durante 14 h con agitación orbital continua. El crecimiento bacteriano se evaluó midiendo la densidad óptica a 550 nm cada 15 minutos. Todas las concentraciones se probaron repetidamente en tres réplicas (n = 3).

Para evaluar la viabilidad bacteriana, las muestras analizadas se dispersaron en medio de crecimiento LB o TSB durante 30 s (A = 18%, W = 250 W, encendido: apagado = 2:1 s) y se mezclaron con bacterias hasta un volumen final de 1 ml. (DO550 = 0,3). Después de la incubación durante 12 h, se centrifugaron 100 µl durante 5 minutos a 6000 rpm y el sobrenadante se reemplazó con 25 µl de prueba de viabilidad bacteriana BacLight viva/muerta (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) que contenía SYTO9 y yoduro de propidio (PI) en 1X. Solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una proporción de 1:1 y una concentración de 3 × 10-6 mg/ml. Fue seguido por una incubación de 15 minutos en la oscuridad para teñir las bacterias. Las bacterias fluorescentes se visualizaron mediante un microscopio de fluorescencia invertida Nikon ECLIPSE Ti-S/L100 (Nikon) acoplado con una cámara Nikon DS-Qi2 (Nikon).

Para evaluar la integridad de la membrana, las muestras analizadas se dispersaron en medio de crecimiento LB o TSB durante 30 s (A = 18%, W = 250 W, encendido: apagado = 2:1 s) y se mezclaron con bacterias hasta un volumen final de 1 ml. (DO550 = 0,3). Después de la incubación durante 12 h, se centrifugaron 100 µl durante 5 minutos a 6000 rpm y el sobrenadante se reemplazó con 50 µl de FM 464 (N-(3-trietilamonio propil)-4-(6-(4-(dietilamino)fenilo. )dibromuro de hexatrienil)piridinio, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)/DAPI (diamidino-2-fenilindol (DAPI; Biotium, Fremont, CA) en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) (que contiene 0,4 μl de 5 mg ml-1 FM 464 y 1 µl de DAPI 125x). Las muestras se tiñeron durante 15 minutos en hielo, se protegieron de la luz y posteriormente se analizaron utilizando un microscopio fluorescente Nikon ECLIPSE Ti-S/L100.

Los análisis morfológicos de las células bacterianas afectadas por el complejo investigado se realizaron utilizando FEISEM (Nova NanoSEM). Se centrifugaron cien microlitros de bacterias incubadas con el complejo durante 12 h durante 5 minutos a 6000 rpm y se fijaron después de reemplazar el medio de crecimiento con 50 µl de glutaraldehído (3% en peso). El paso de fijación se realizó durante 3 h a temperatura ambiente. Las bacterias fijadas se depositaron sobre membranas porosas mediante filtración al vacío suave, se lavaron tres veces con PBS (durante 15 minutos para cada lavado) y se deshidrataron en etanol diluido en serie (30, 50, 70, 90 y 100% en peso, 30 minutos a cada concentración). Las muestras se secaron en los puntos críticos.

Las pruebas se realizaron en células A549 epiteliales de pulmón humano (ATCC® CCL-185™). Las células se cultivaron en DMEM/F-12 (Gibco, Thermo Fisher Scientific) suplementado con penicilina-estreptomicina al 1% (v/v) (Gibco, Thermo Fisher Scientific) y suero bovino fetal descomplementado al 10% (v/v) (Gibco, Thermo Fisher Scientific) y se cultivaron en una incubadora humidificada (Memmert) a 37 °C y 5 % (v/v) de CO2. El complejo probado se dispersó ultrasónicamente en DMEM durante 30 s (A = 18%, W = 250 W, encendido: apagado = 2:1 s) para formar una solución madre (2 mg/ml). Las células cultivadas hasta la confluencia en una placa de 96 pocillos se trataron con diluciones en serie del complejo y se incubaron a 37 °C en CO2 al 5% durante 24 h. El ensayo de citotoxicidad se realizó añadiendo 20 µl de 10 x reactivo de viabilidad celular Presto blueTM (Molecular Probes, Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific) por pocillo, incubando durante 30 minutos y registrando la fluorescencia en la excitación λ = 560 nm y la emisión λ = 590 nm. . Las referencias incluyeron el complejo sin células en DMEM, el tinte puro en DMEM, células sin el complejo (como control negativo) y células con DMSO (como control positivo). Todas las concentraciones se probaron repetidamente por triplicado (n = 3). La viabilidad se ha normalizado para las células sin tratamiento (% de viabilidad respecto al control negativo).

Las larvas de Galleria mellonella, utilizadas como modelo in vivo35, se cultivaron a 34 °C hasta alcanzar un peso de 200 a 250 mg. El complejo investigado se dispersó en PBS durante el estudio de toxicidad utilizando ultrasonido (30 s, A = 18%, W = 250 W, encendido: apagado = 2:1 s) para formar una solución madre de 5 mg/ml. Se inyectó un inóculo de 10 µl de la dispersión compleja (en diferentes concentraciones) en el área superior derecha de las larvas utilizando una jeringa Hamilton de calibre 22. Cada concentración del complejo se inyectó en cinco larvas por grupo de prueba (n = 5). Al grupo de control se le inoculó 10 µl de 1x PBS (Fisher Scientific) de la misma manera. Después de la inoculación, las larvas se mantuvieron a 37 °C por hasta 72 h. La mortalidad larvaria se observó cada 16 a 24 h. Las pruebas se realizaron repetidamente. Las curvas de supervivencia se trazaron mediante el análisis de Kaplan-Meier y las diferencias estadísticamente significativas se determinaron mediante la prueba de rango logarítmico unilateral (software GraphPad 9.0).

Durante el estudio de eficacia, se preinyectaron larvas de G. mellonella con 10 µl de una dosis infecciosa de P. aeruginosa (PAO1) (6,4 × 103 ufc/ml) en el área superior derecha de la pierna. Una hora después de la infección, se inyectó en la pierna superior izquierda un inóculo de 10 µl que contenía diferentes concentraciones del complejo probado dispersado en PBS. El siguiente procedimiento fue el mismo que para el estudio de toxicidad. A los controles se les inyectó larvas con 1x PBS (control negativo) y a las larvas se les inyectó ciprofloxacina (sin complejo) a 10 mg/kg (control positivo). Cada grupo analizado contenía cinco larvas (n = 5).

Los experimentos se realizaron al menos por triplicado y se repitieron 2 o 3 veces (depende del experimento). Los resultados se presentan como valor medio ± DE. Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante la prueba de rango logarítmico unilateral (software GraphPad 9.0).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios. Los archivos fuente detrás de las Figs. 2, 4, 5, 6 y 9 se presentan en los archivos de Datos complementarios 1 a 5, respectivamente. Los archivos fuente detrás de las Figs. Suplementarias. 1 a 4 y 6 se proporcionan en los archivos de Datos complementarios 6 a 10, respectivamente.

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Los autores agradecen a Ángel Blanco Blanes y al Dr. Samuel Sánchez del grupo de Nano-Bio-Dispositivos Inteligentes del Instituto de Bioingeniería de Cataluña por las mediciones del potencial zeta, así como al Dr. Dušan Žigon del Centro de Espectrometría de Masas del Instituto Jozef Stefan de Análisis ToF MS. La Comisión Europea ha financiado este trabajo en el marco del esquema COFUND de Acciones Marie Skłodowska-Curie de Horizonte 2020 (Acuerdo de subvención nº 712754) y del programa Severo Ochoa del Ministerio de Ciencia y Competitividad de España (Subvención SEV-2014-0425 (2015-2019) ). La ET contó con el apoyo de subvenciones del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO/FEDER) (RTI2018-098573-B-100), la Generalitat de Catalunya (programa 2017SGR-1079 y CERCA), las asociaciones catalanas de Fibrosis Quística y la Fundación La Caixa. . MV recibió apoyo financiero adicional mediante subvenciones de la Agencia Eslovena de Investigación (ARRS) (subvenciones J2-8169, N2-0150 y P2-0091).

Departamento de Materiales Avanzados, Instituto Jozef Stefan, Jamova 39, Liubliana, Eslovenia

Marija Vukomanovic, Lea Gazvoda, Mario Kurtjak y Blaž Jaklic

Escuela Internacional de Postgrado de Jozef Stefan, Jamova 39, Ljubljana, Eslovenia

Marija Vukomanovic, Lea Gazvoda y Blaž Jaklic

Centro de Microscopía y Microanálisis Electrónicos (CEMM), Instituto Jozef Stefan, Jamova 39, Ljubljana, Eslovenia

Jitka Hresčak

Infecciones bacterianas: terapias antimicrobianas, Instituto de Bioingeniería de Cataluña (IBEC), Instituto de Ciencia y Tecnología, Baldiri Reixac 15-21, 08028, Barcelona, España

Laura Moya-Andérico, María del Mar Ceniza & Eduard Torrents

Sección de Microbiología, Departamento de Genética, Microbiología y Estadística, Facultad de Biología, Universidad de Barcelona, Av. Diagonal 643, 08028, Barcelona, España

Eduardo Torrentes

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Concepto, síntesis y caracterización de la investigación de MV, redacción del primer borrador; Análisis LG XRD y FTIR, análisis MK TEM y EDS, análisis JH STEM y mapeo elemental, análisis BJ XPS, LM-A. estudio in vivo, toxicidad in vitro de MC, tutoría y financiación de ET. Todos los autores contribuyeron a la edición del texto hasta la versión final.

Correspondencia a Marija Vukomanovic o Eduard Torrents.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a John-Sigurd Svendsen y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editora principal: Christina Karlsson Rosenthal.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Vukomanovic, M., Gazvoda, L., Kurtjak, M. et al. Desarrollo de un complejo antimicrobiano ternario ciclodextrina-arginina-ciprofloxacina con mayor estabilidad. Común Biol 5, 1234 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04197-9

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Recibido: 12 de mayo de 2022

Aceptado: 31 de octubre de 2022

Publicado: 12 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04197-9

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