Los glucocorticoides aumentan la protección de las células del tejido contra los poros.

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 186 (2023) Citar este artículo

1268 Accesos

3 altmétrico

Detalles de métricas

Muchas especies de bacterias patógenas dañan las células de los tejidos al secretar toxinas que forman poros en las membranas plasmáticas. Aquí mostramos que los glucocorticoides aumentan la protección intrínseca de las células del tejido contra las toxinas que forman los poros. La dexametasona protegió varios tipos de células contra la citolisina dependiente del colesterol, la piolisina, de Trueperella pyogenes. El tratamiento con dexametasona redujo la fuga de potasio y lactato deshidrogenasa inducida por piolisina, limitó las alteraciones del citoesqueleto de actina, redujo las ampollas en la membrana plasmática y evitó la citólisis. La hidrocortisona y la fluticasona también protegieron contra el daño celular inducido por la piolisina. Además, la dexametasona protegió las células HeLa y A549 contra las toxinas formadoras de poros estreptolisina O de Streptococcus pyogenes y alfa-hemolisina de Staphylococcus aureus. La citoprotección con dexametasona no se asoció con cambios en el colesterol celular ni con la activación de las respuestas al estrés celular de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK). Sin embargo, la citoprotección dependía del receptor de glucocorticoides y de la 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A reductasa (HMGCR). En conjunto, nuestros hallazgos implican que los glucocorticoides podrían aprovecharse para limitar el daño tisular causado por patógenos que secretan toxinas formadoras de poros.

Muchas especies de bacterias patógenas secretan toxinas que forman poros en la membrana plasmática de las células eucariotas1,2. Estas toxinas que forman poros causan daño celular y citólisis, lo que contribuye a la virulencia bacteriana y al desarrollo de enfermedades. Sin embargo, el tratamiento con glucocorticoides reduce la gravedad de algunas enfermedades bacterianas3,4,5. Suponemos que estos efectos beneficiosos se deben en parte a que los glucocorticoides frenan la inflamación y la inmunopatología6. Aquí, exploramos si los glucocorticoides también pueden ayudar a las células de los tejidos a protegerse contra el daño causado por las toxinas que forman los poros.

Las toxinas formadoras de poros permiten la entrega de factores de virulencia bacteriana a las células eucariotas, provocan la fuga de moléculas citosólicas que las bacterias utilizan como nutrientes y facilitan la invasión bacteriana1,2. Los patógenos que secretan toxinas formadoras de poros incluyen Trueperella pyogenes, que causa infecciones purulentas en animales de granja, Streptococcus pyogenes, que causa faringitis e impétigo en niños, y Staphylococcus aureus, que causa neumonía, sepsis e infecciones de la piel en animales y humanos2,7, 8,9,10. Trueperella pyogenes y Streptococcus pyogenes producen piolisina y estreptolisina O, respectivamente, que son miembros de la familia más común de toxinas formadoras de poros, las citolisinas dependientes del colesterol. Las citolisinas dependientes del colesterol se unen al colesterol de la membrana plasmática y luego forman los poros de la membrana11,12. Moléculas de piolisina que forman poros transmembrana de barril β de 18 nm de diámetro interno y moléculas de estreptolisina que forman poros de 26 nm de diámetro9,13,14. Estos poros provocan la salida de potasio de las células, la entrada de calcio, la fuga de proteínas citosólicas como la lactato deshidrogenasa (LDH), alteraciones del citoesqueleto de actina y citolisis15,16,17. Staphylococcus aureus secreta una α-hemolisina que se une a las membranas plasmáticas, donde 7 moléculas se oligomerizan para formar un poro transmembrana de barril β de 1,4 nm de diámetro interno, lo que también conduce a la fuga de moléculas citosólicas y a la citolisis7,18,19. Prevenir o reducir la gravedad de la enfermedad depende de que el sistema inmunológico elimine y elimine las bacterias patógenas y de que limite el daño tisular causado por los patógenos y la respuesta inmunitaria20. Aunque las células pueden reparar el daño causado por las toxinas formadoras de poros15,21,22,23, se sabe poco sobre la protección intrínseca de las células contra estas toxinas.

Los glucocorticoides se secretan para fomentar la adaptación metabólica, inhibir la inflamación y apoyar la reparación de los tejidos, como parte de la respuesta al estrés ante la infección6,24,25. Los glucocorticoides se unen al receptor de glucocorticoides (GR, codificado por NR3C1) ampliamente expresado, lo que conduce a la represión del factor de transcripción, la regulación genética y los efectos no genómicos24,25,26,27. Los efectos pleiotrópicos de los glucocorticoides suelen ser específicos del tipo de célula y del contexto, e incluyen restringir la inmunidad innata, inhibir las respuestas al estrés de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), suprimir la producción de mediadores inflamatorios y alterar el metabolismo celular24,25,26,27. Los glucocorticoides como la dexametasona, la hidrocortisona y la fluticasona se utilizan como fármacos antiinflamatorios para limitar la inflamación y la inmunopatología asociadas con las infecciones bacterianas6,24,25,28. Sin embargo, sugerimos que los glucocorticoides también pueden estimular la protección intrínseca de las células de los tejidos contra el daño causado por patógenos. Si los glucocorticoides pueden aumentar la protección de las células de los tejidos contra las toxinas que forman los poros, esto tendría implicaciones importantes para el beneficio del uso de tratamientos con esteroides para prevenir o limitar la patología causada por la infección con bacterias patógenas.

Aquí probamos la hipótesis de que los glucocorticoides ayudan a las células de los tejidos a protegerse contra el daño causado por las toxinas que forman los poros. Descubrimos que el tratamiento con dexametasona, hidrocortisona o fluticasona protegía varios tipos de células contra el daño causado por las citolisinas dependientes del colesterol o la α-hemolisina. Los glucocorticoides aumentaron la protección intrínseca de las células y la citoprotección dependía del receptor de glucocorticoides y de la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis del colesterol, la 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A reductasa (HMGCR). Esta citoprotección de glucocorticoides no reconocida previamente se suma al papel establecido de los glucocorticoides que limitan la gravedad de las enfermedades bacterianas al suprimir la inflamación y la inmunopatología.

La piolisina es útil para estudiar la citoprotección porque forma poros en la membrana plasmática de muchos tipos de células eucariotas8,10. Además, a diferencia de la mayoría de las citolisinas dependientes del colesterol, la piolisina no requiere activación química con agentes reductores in vitro. Utilizamos células HeLa porque estas células epiteliales cervicales se utilizan a menudo para explorar las respuestas celulares a las citolisinas15,16,21,29. Para determinar un desafío de piolisina adecuado para explorar la citoprotección, primero cultivamos células en placas de 24 pocillos en medio sin suero durante 24 h y luego las desafiamos con un rango de cantidades de piolisina durante 2 h. Se utilizó un medio libre de suero para evitar efectos de confusión del colesterol sérico, la globulina fijadora de corticosteroides y la activación de las vías de señalización celular30. Las células se expusieron a piolisina durante 2 h porque es tiempo suficiente para causar daño celular10,31 y porque los desafíos más prolongados también podrían reflejar reparación o replicación celular. La exposición a piolisina provocó la fuga de LDH hacia los sobrenadantes celulares y redujo la viabilidad celular según lo determinado por ensayos de MTT (Fig. 1a). La exposición a piolisina también provocó la pérdida de potasio intracelular (Fig. 1b), alteró el citoesqueleto de actina y la forma de las células (paneles superiores, Fig. 1c, Fig. 1a-c complementaria) e indujo ampollas en la membrana plasmática (Fig. 1d complementaria). Seleccionamos 100 HU/pocillo de piolisina para experimentos de citoprotección porque esto causó> 80% de citolisis.

a Las células HeLa se expusieron a piolisina y se midió la fuga de LDH en los sobrenadantes y se determinó la viabilidad celular mediante ensayo MTT después de 2 h, ob el potasio intracelular medido después de 5 min. Los datos son media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional. c Imágenes de microscopio fluorescente de células tratadas con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h, luego expuestas a control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h y teñidas con faloidina fluorescente (blanco) y DAPI (rojo), con imágenes representativas de 4 experimentos independientes. d Las células se trataron con vehículo o dexametasona durante 24 h, se expusieron a control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h, y se cuantificó la fuga de LDH y la viabilidad celular. Los datos son media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos vías y se informaron los valores de P para el efecto del tratamiento en la exposición a piolisina. e Las células se trataron con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h, se expusieron a control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 5 minutos y se cuantificó el potasio intracelular. Los datos son media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Dunnett. f Las células se trataron con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h, se expusieron a piolisina durante 2 h y se cuantificó la fuga de LDH y la viabilidad celular. Los datos provienen de 4 experimentos independientes; la significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores; las líneas representan medias. g Las células se trataron con dexametasona 10 µM durante los tiempos indicados, se expusieron a control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h y se cuantificó la viabilidad celular. Los datos de piolisina son porcentajes del desafío de control, con puntos que representan valores individuales en 3 experimentos independientes; la recta es la que encaja por mínimos cuadrados. h Las células se trataron con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h, se expusieron a control o 100 HU/pocillo de piolisina durante los tiempos indicados y se determinó la viabilidad celular. Los datos de piolisina son porcentajes de desafío de control de 4 experimentos independientes; las líneas representan medias.

Investigamos si el tratamiento de las células HeLa con dexametasona durante 24 h las protegía contra una exposición posterior a piolisina de 2 h, sin tratamiento adicional con dexametasona. La dexametasona redujo la fuga de LDH y la citólisis inducidas por piolisina (Fig. 1d). Tan solo 0,01 µM de dexametasona redujo tanto la fuga de LDH como la citólisis (P < 0,001), y 10 µM de dexametasona redujeron la fuga de LDH en un 84% y redujeron la citólisis del 83% al 9%. El tratamiento con dexametasona 10 µM también limitó las alteraciones inducidas por piolisina en la forma de las células y el citoesqueleto de actina (Fig. 1c, Fig. 1a-c complementaria; 28 ± 2% frente a 88 ± 2% de células dañadas; n = 3 experimentos independientes, Chi-cuadrado , P <0,01) y reducción de la formación de ampollas en la membrana plasmática inducida por piolisina (Tabla 1). El tratamiento con dexametasona 10 µM también redujo la pérdida de potasio intracelular después de una exposición a piolisina de 5 minutos (Fig. 1e).

La dexametasona fue eficaz contra 50 a 200 HU/pocillo de piolisina (Fig. 1f), y la citoprotección fue evidente cuando las células HeLa se trataron con dexametasona durante ≥ 6 h (Fig. 1g). Además, el tratamiento con dexametasona 10 µM durante 24 h protegió a las células contra los desafíos de piolisina que duraron entre 1 y 24 h (Fig. 1h). En conjunto, estos datos proporcionan evidencia de la citoprotección de las células HeLa con dexametasona contra la piolisina.

Para explorar si la citoprotección de dexametasona contra la piolisina se extendía más allá de las células HeLa, utilizamos células epiteliales pulmonares A549 porque también se usan con frecuencia para explorar las respuestas a las citolisinas19,32. Las células A549 desafiantes con ≥ 25 HU/pocillo de piolisina durante 2 h indujeron una fuga de LDH y redujeron la viabilidad celular (ANOVA, P <0,001, figura complementaria 2a). Sin embargo, el tratamiento de células A549 con dexametasona durante 24 h redujo la fuga de LDH y la citólisis después de una exposición de 2 h con 25 HU/pocillo de piolisina (Fig. 2a), y redujo la pérdida de potasio intracelular después de una exposición de 5 minutos (Fig. 2b). El tratamiento con dexametasona 10 µM también redujo las alteraciones inducidas por piolisina en la forma de las células y el citoesqueleto de actina (Fig. 2c; 7 ± 4 vs 71 ± 5% de células dañadas, n = 3 experimentos independientes, Chi-cuadrado, P <0,01). La citoprotección con dexametasona fue eficaz contra 12,5 a 100 HU/pocillo de piolisina (Fig. 2d).

a Se trataron células A549 con vehículo o dexametasona durante 24 h, se expusieron a control o 25 HU/pocillo de piolisina durante 2 h, y se cuantificó la fuga de LDH y la viabilidad celular. Los datos son media + sem de 3 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores y se informaron los valores de P para el efecto del tratamiento sobre la exposición a piolisina. b Las células A549 se trataron con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h, se expusieron a control o 25 HU/pocillo de piolisina durante 5 minutos y se cuantificó el potasio intracelular. Los datos son media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Dunnett. c Imágenes de microscopio fluorescente de células A549 tratadas con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h, desafiadas con control o 25 HU/pocillo de piolisina durante 2 h y teñidas con faloidina fluorescente (blanco) y DAPI (rojo); Las imágenes son representativas de 3 experimentos independientes. Se trataron células d A549 con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h, se expusieron a piolisina durante 2 h y se cuantificó la fuga de LDH y la viabilidad celular. Los datos son media ± sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores. e Las células Hep-G2, las células NCI-H441 y los fibroblastos dérmicos se trataron con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h, se expusieron a control o piolisina durante 2 h (Hep-G2, 100 HU/pocillo; NC1-H441, 200 HU/ pocillo; fibroblastos dérmicos humanos primarios, 25 HU/pocillo), y se midió la fuga de LDH y se cuantificó la viabilidad celular mediante ensayo MTT o CYQUANT (fibroblastos). Los datos son media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores, con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. f Se trataron fibroblastos de pulmón humano, células PNT2, células Met5A o condrocitos humanos primarios con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h, se expusieron a las cantidades indicadas de piolisina durante 2 h y se cuantificó la viabilidad celular. Los datos son media ± sem de 3 o 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores.

También probamos la citoprotección de la dexametasona contra la piolisina utilizando otros siete tipos diferentes de células humanas. La fuga de LDH y la citólisis fueron evidentes después de una exposición de 2 h con 100 HU/pocillo de piolisina en células hepáticas Hep-G2, 200 HU/pocillo de piolisina en células epiteliales pulmonares NC1-H441 y 25 HU/pocillo de piolisina en fibroblastos dérmicos normales primarios ( Figura complementaria 2b-d). Sin embargo, el tratamiento con dexametasona 10 µM durante 24 h redujo la fuga de LDH y la citólisis después de una exposición a piolisina de 2 h en células Hep-G2, células NCI-H441 y fibroblastos dérmicos (Fig. 2e). El tratamiento con dexametasona 10 µM durante 24 h también redujo la citólisis después de una exposición de 2 h con un rango de cantidades de piolisina en fibroblastos primarios de pulmón humano normal, y PNT2 SV40 transformó células epiteliales de próstata normales, aunque no en Met5A SV40 transformó células mesoteliales normales o primarias. condrocitos humanos (Fig. 2f). Finalmente, el tratamiento con dexametasona 100 µM durante 24 h redujo la citólisis después de una exposición de 2 h con 200 HU de piolisina en células epiteliales endometriales bovinas primarias (dexametasona 48,2 ± 7,8 % frente a vehículo 82,8 ± 1,2 citólisis, P = 0,015, n = 4 experimentos independientes). .

Examinamos si otros glucocorticoides distintos de la dexametasona podrían proteger las células contra la piolisina. El tratamiento de las células HeLa con hidrocortisona durante 24 h redujo la fuga de LDH y la citólisis después de una exposición a piolisina de 2 h (Fig. 3a) y redujo la pérdida de potasio intracelular después de una exposición de 5 minutos (Fig. 3b). Además, la hidrocortisona 10 µM redujo las alteraciones inducidas por la piolisina en la forma de las células HeLa y el citoesqueleto de actina (32 ± 9 % frente a 88 ± 2 % de las células dañadas; n = 3 experimentos independientes, Chi-cuadrado, P < 0,01), y redujo la piolisina. formación de ampollas inducidas en la membrana plasmática (Tabla 1). La citoprotección fue evidente cuando las células se trataron con hidrocortisona durante ≥ 6 h (Figura complementaria 3a). El tratamiento de las células HeLa con el agonista selectivo del receptor de glucocorticoides, propionato de fluticasona28, también redujo la fuga de LDH y la citólisis después de una exposición a piolisina de 2 h (Fig. 3c).

a Las células HeLa se trataron con vehículo o hidrocortisona durante 24 h, se expusieron a control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h, y se cuantificó la fuga de LDH y la viabilidad celular. Los datos son media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores y se informaron los valores de P para el efecto del tratamiento sobre la exposición a piolisina. b Las células HeLa se trataron con vehículo o hidrocortisona 10 µM durante 24 h, se expusieron a control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 5 minutos y se cuantificó el potasio intracelular. Los datos son media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Dunnett. c Las células HeLa se trataron con vehículo o propionato de fluticasona durante 24 h, se expusieron a control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h, y se cuantificó la fuga de LDH y la viabilidad celular. Los datos son media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores y se informaron los valores de P para el efecto del tratamiento sobre la exposición a piolisina. d – f Los experimentos a – c, respectivamente, se repitieron utilizando células A549 expuestas a 25 HU/pocillo de piolisina.

El tratamiento de las células A549 con hidrocortisona durante 24 h redujo la fuga de LDH y la citólisis después de una exposición a piolisina de 2 h (Fig. 3d); y tendió a reducir la pérdida de potasio intracelular después de una provocación de 5 minutos (Fig. 3e). Además, la hidrocortisona 10 µM redujo las alteraciones inducidas por la piolisina en la forma de las células A549 y el citoesqueleto de actina (16 ± 4 frente a 71 ± 5% de células dañadas, n = 3 experimentos independientes, Chi-cuadrado, P <0,01). La fluticasona también redujo la fuga de LDH inducida por piolisina y la citólisis en células A549 (Fig. 3f).

A continuación, exploramos si la dexametasona podría proteger las células contra toxinas formadoras de poros distintas de la piolisina, utilizando estreptolisina O y Staph. aureus α-hemolisina. La desafío a las células HeLa o A549 con estreptolisina O resultó en fuga de LDH y citólisis después de una provocación de 2 h (Figuras complementarias 4a, b). Sin embargo, el tratamiento de células HeLa o células A549 con dexametasona 10 µM durante 24 h redujo la fuga de LDH y la citólisis después de una exposición a estreptolisina O de 2 h, y redujo la pérdida de potasio intracelular después de una exposición de 5 minutos (Fig. 4a, b). El tratamiento con dexametasona también redujo la fuga de LDH y la citólisis luego de la exposición a un rango de concentraciones de estreptolisina O durante 2 h (Figuras complementarias 4a, b).

a, b Se trataron células HeLa y células A549, respectivamente, con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h, se expusieron a control o estreptolisina O (HeLa, 12,5 µg/pocillo; A549, 6,25 µg/pocillo), y se filtraron células y fugas de LDH. viabilidad cuantificada después de 2 h o potasio intracelular medido después de 5 min. Los datos son media + sem de 3 o 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores, con la prueba de comparaciones múltiples de Šídák. c, d Se trataron células HeLa y células A549, respectivamente, con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h, se expusieron a control o a 8 µg/pocillo de α-hemolisina, y se cuantificó la fuga de LDH y la viabilidad celular después de 24 h o se midió el potasio celular después 15 minutos. Los datos son media + sem de 3 o 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores, con la prueba de comparaciones múltiples de Šídák.

El desafío a las células HeLa o A549 con 8 µg/pocillo de α-hemolisina dio como resultado una fuga de LDH y citólisis después de 24 h (Figuras complementarias 4c, d). Sin embargo, el tratamiento de las células HeLa con dexametasona durante 24 h redujo la fuga de LDH y la citólisis después de una exposición posterior a α-hemolisina de 24 h, y redujo la pérdida de potasio intracelular después de una exposición de 15 minutos (Fig. 4c, Fig. 4e complementaria). El tratamiento con dexametasona de las células A549 también redujo la fuga de LDH inducida por α-hemolisina, pero no alteró significativamente la citólisis ni la pérdida de potasio intracelular (Fig. 4d, Fig. 4f complementaria). La dexametasona previno las alteraciones inducidas por la α-hemolisina en la forma y el citoesqueleto de las células HeLa (Figura complementaria 4g, 17 ± 4 frente a 86 ± 3 % de células dañadas, Chi-cuadrado, n = 3 experimentos independientes, P <0,01), pero no A549 células (Figura complementaria 4h, 89 ± 2 frente a 76 ± 6% de células dañadas). En conjunto, los datos de las Figs. 1-4 proporcionan evidencia de la citoprotección con glucocorticoides de las células del tejido eucariota contra las toxinas formadoras de poros y, en particular, de la dexametasona que aumenta la protección intrínseca de las células contra la piolisina.

Las toxinas formadoras de poros, incluidas la piolisina, la estreptolisina O y la α-hemolisina, activan la respuesta al estrés de las células MAPK después de la salida de potasio o la entrada de calcio15,29,33,34,35. Por lo tanto, mejorar la activación de MAPK, la salida de potasio celular o la entrada de calcio son mecanismos potenciales para proteger las células contra las citolisinas. Sin embargo, la dexametasona o la hidrocortisona no estimularon la fosforilación de ERK1/2, p38 o JNK en células HeLa (Fig. 5). En cambio, el tratamiento con glucocorticoides evitó la fosforilación inducida por piolisina de ERK1/2, p38 y JNK, lo que es consistente con la supresión de MAPK por glucocorticoides24,25, o con la prevención del daño inducido por piolisina, como lo demuestra el uso del agente que reduce el colesterol, metil-β-ciclodextrina36. . Además, la dexametasona permaneció citoprotectora cuando las células fueron expuestas a piolisina en un tampón con alto contenido de potasio para limitar el flujo de salida de potasio (Figura 5a complementaria), o en condiciones sin calcio para limitar la entrada de calcio (Figura 5b complementaria).

Transferencia Western representativa de ERK1/2 fosforilada y total, p38 y JNK, y α-tubulina para células HeLa tratadas con vehículo, dexametasona 10 µM, hidrocortisona 10 µM o metil-β-ciclodextrina (MβCD) 1 mM durante 24 h, y luego desafiados con control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 10 min. Los datos de densitometría se normalizaron para α-tubulina y se presentaron como media + sem de 3 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA con la prueba post hoc de Tukey.

La reducción del colesterol celular protege a las células contra las citolisinas dependientes del colesterol y la α-hemolisina10,17,19. Como se esperaba, el tratamiento con metil-β-ciclodextrina 1 mM durante 24 h redujo el colesterol celular total en células HeLa (Fig. 6a), sin reducir la viabilidad celular (Fig. 6a complementaria). Sin embargo, el tratamiento con dexametasona o hidrocortisona no redujo el colesterol total de las células HeLa (Fig. 6a). En las células A549, los glucocorticoides incluso aumentaron el colesterol de las células A549 (Figura complementaria 6b).

a Las células HeLa se trataron con vehículo, metil-β-ciclodextrina (MβCD) 1 mM, dexametasona o hidrocortisona durante 24 h y se midió el colesterol celular total. Los datos son media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. b Las células HeLa se cultivaron con vehículo o SZ5-035 10 µM durante 16 h antes del tratamiento con vehículo, dexametasona 10 µM o 27-hidroxicolesterol (27-HC) 10 ng/ml durante 24 h, en presencia continua de vehículo o SZ5. -035; luego se desafió con control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h, y se cuantificó la fuga de LDH y la viabilidad celular. Los datos son media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. c Transferencia Western representativa de unión de piolisina y α-tubulina para células HeLa tratadas con vehículo, dexametasona 10 µM, hidrocortisona 10 µM, T0901317 50 nM, 27-hidroxicolesterol (27-HC) 10 ng/ml o metil-β-ciclodextrina 1 mM (MβCD) durante 24 h, y luego se desafió con control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h. Los datos de densitometría (panel derecho) se normalizaron para α-tubulina y se presentaron como media + sem de 4 experimentos; La significación estadística se determinó mediante ANOVA con la prueba post hoc de Tukey.

Las citolisinas dependientes del colesterol se unen a una reserva lábil de colesterol accesible en las membranas plasmáticas11,12. Esto es importante porque los hidroxicolesterol de cadena lateral estimulan la esterificación del colesterol a través de la acilcoenzima A: colesterol aciltransferasa (ACAT) para reducir el colesterol accesible a la membrana plasmática, lo que protege a los macrófagos contra las citolisinas dependientes del colesterol sin reducir el colesterol celular total e inhibe la ACAT con SZ58-035. disminuye esta protección37. Usando 27-hidroxicolesterol como control positivo para reducir el colesterol accesible37, también encontramos que el cultivo de células HeLa con SZ58-035 disminuyó la citoprotección del 27-hidroxicolesterol contra una exposición posterior a citolisina de 2 h (Fig. 6b). Sin embargo, aunque también se cree que la dexametasona estimula ACAT38, el cultivo de células HeLa con SZ58-035 no alteró significativamente la protección de la dexametasona contra la fuga o citólisis de LDH inducida por piolisina (Fig. 6b).

En un enfoque independiente, examinamos si los glucocorticoides alteran el colesterol accesible a la membrana plasmática midiendo la unión de piolisina a las células HeLa11. Primero verificamos que el tratamiento de las células HeLa con un agonista del receptor X del hígado (T0901317; Tocris, Abingdon, Reino Unido), 27-hidroxicolesterol o metil-β-ciclodextrina disminuyó la unión de piolisina (Fig. 6c). Sin embargo, el tratamiento de las células con dexametasona o hidrocortisona no tuvo ningún efecto significativo sobre la unión de piolisina. En conjunto, estos resultados sugieren que la citoprotección con glucocorticoides no estuvo mediada por la reducción del colesterol accesible a la membrana plasmática.

Utilizamos un medio sin suero en nuestros experimentos para evitar los efectos de confusión del colesterol sérico, los esteroides, la globulina transportadora de corticosteroides y la LDH, y para evitar la activación sérica de las vías de señalización genética y celular30,39. De hecho, la citoprotección con glucocorticoides contra la piolisina se evitó cultivando células HeLa en ≥ 6% de suero bovino fetal (Fig. 7a) o cultivando células A549 con 10% de suero (Fig. 7 complementaria). Incluso el cultivo de células HeLa con suero despojado de carbón al 10%, que tiene niveles reducidos de colesterol y esteroides40, evitó la citoprotección de la dexametasona contra la piolisina (Fig. 7b). Además, cuando las células HeLa cultivadas en medios sin suero se trataron con dexametasona durante 24 h, la citoprotección se eliminó si se añadió suero al 10% durante ≥ 6 h antes de la exposición a piolisina (Fig. 7c; ANOVA, prueba post hoc de Dunnett, P < 0,05). Por el contrario, la citoprotección se restableció reemplazando el medio que contenía 10% de suero y dexametasona 10 µM, con medio libre de suero sin dexametasona durante ≥ 8 h antes de una exposición a piolisina (Fig. 7d; ANOVA, prueba post hoc de Dunnett, P <0,05). En conjunto, estos datos proporcionan evidencia de que el suero puede disminuir de manera reversible la citoprotección de glucocorticoides contra la piolisina.

a Se trataron células HeLa con dexametasona 10 µM durante 24 h en un medio que contenía las concentraciones séricas indicadas, luego se expusieron a 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h y se cuantificó la viabilidad celular mediante ensayo MTT. Los datos son media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA. b Las células HeLa se trataron con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h en medio con o sin suero despojado al 10%, luego se expusieron a control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h y se cuantificó la viabilidad celular. Los datos son media + sem de 3 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. c Las células HeLa se trataron con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h en medio suplementado con suero al 10 % en el momento indicado antes de ser expuestas a control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h, y se cuantificó la viabilidad celular. Los datos son el porcentaje de viabilidad del desafío de control, los puntos representan valores individuales de 4 experimentos independientes y la línea es el ajuste de mínimos cuadrados. d Las células HeLa se trataron con dexametasona 10 µM en medio con o sin suero al 10%, luego, en los momentos indicados, se descartaron los sobrenadantes y el medio se cambió a medio libre de suero durante el resto de las 24 h, antes de que las células fueran expuestas a control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h, y se cuantificó la viabilidad celular. Los datos son porcentajes de células viables en comparación con el desafío de control, los puntos representan valores individuales de 3 experimentos independientes y las líneas son ajustes de mínimos cuadrados.

Luego investigamos si el receptor de glucocorticoides era importante para la citoprotección porque los glucocorticoides también pueden reprimir factores de transcripción y ejercer efectos no genómicos24,25,26,27. El cultivo de células HeLa o A549 con el antagonista del receptor de glucocorticoides RU48641 disminuyó la citoprotección de dexametasona e hidrocortisona contra la piolisina (Fig. 8a, b; Fig. 8 complementaria). De manera similar, el uso de ARNip dirigido a NR3C1 para agotar el receptor de glucocorticoides en las células HeLa (Fig. 8c), disminuyó la citoprotección de dexametasona e hidrocortisona contra la piolisina (Fig. 8d). En conjunto, estos experimentos proporcionan evidencia de que la citoprotección de dexametasona e hidrocortisona contra la piolisina dependía del receptor de glucocorticoides.

a Las células HeLa se trataron con vehículo o dexametasona 10 µM, o b hidrocortisona 10 µM, en medio con o sin RU486 10 µM durante 24 h, luego se expusieron a control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h, y fuga de LDH y viabilidad celular. cuantificado. Los datos son media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores y la prueba post hoc de Bonferroni. c Transferencias Western del receptor de glucocorticoides (GR) y α-tubulina para células HeLa transfectadas con ARNip codificado o ARNip dirigido a NR3C1; Las imágenes son representativas de 4 experimentos independientes. d Se transfectaron células HeLa durante 48 h con ARNip codificado o ARNip dirigido a NR3C1, se trataron con vehículo, dexametasona 10 µM o hidrocortisona 10 µM durante 24 h, luego se expusieron a control o 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h, y se filtró LDH y células. viabilidad cuantificada. Los datos son media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores y la prueba post hoc de Bonferroni.

Finalmente consideramos si la citoprotección contra la piolisina podría depender de que el receptor de glucocorticoides active un gen específico porque la citoprotección requería tratamiento con dexametasona durante ≥ 6 h (Fig. 1g), y la citoprotección se excluía cuando las células se cultivaban con actinomicina para inhibir la transcripción genética (Fig. 9a). ) o con cicloheximida para inhibir la traducción (Fig. 9b). Como el suero previno reversiblemente la citoprotección de glucocorticoides, buscamos en la literatura genes regulados de manera opuesta por los glucocorticoides y el suero. Aunque los glucocorticoides y el suero regulan numerosos genes26,30,39, identificamos 19 genes regulados tanto por la dexametasona como por el suero, de los cuales sólo 11 estaban regulados de manera opuesta (Tabla complementaria 1). Si bien parecía mecánicamente improbable que la mayoría de estos genes contribuyeran a la citoprotección, un candidato potencial era HMGCR, que codifica la enzima limitante de la velocidad en la vía del mevalonato para la biosíntesis del colesterol42. Los glucocorticoides aumentan la expresión de HMGCR, mientras que el suero reduce la expresión de HMGCR43. El uso de ARNip para atacar el HMGCR en células HeLa disminuyó la citoprotección de dexametasona contra la piolisina (Fig. 9c, Fig. 9 complementaria). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la citoprotección con dexametasona depende al menos parcialmente de HMGCR.

a Se cultivaron células HeLa en medio o con 1 µg/ml de cicloheximida o b 0,25 µg/ml de actinomicina D, y se trataron con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h, y luego se expusieron a medio de control o 100 HU de piolisina durante 2 h. La fuga de LDH a los sobrenadantes se midió después de 2 h y las células viables se determinaron mediante ensayo MTT. Los datos se presentan como media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. c Las células HeLa se transfectaron durante 48 h con ARNip codificado o ARNip dirigido a HMGCR, se trataron con vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h y luego se expusieron a medio de control o piolisina 100 HU durante 2 h. La fuga de LDH a los sobrenadantes se midió después de 2 h y las células viables se determinaron mediante ensayo MTT. Los datos se presentan como media + sem de 4 experimentos independientes; La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos factores y la prueba de comparación múltiple de Bonferroni.

Encontramos evidencia de un efecto citoprotector no identificado previamente de los glucocorticoides contra las toxinas formadoras de poros. La piolisina, la estreptolisina O y la α-hemolisina formaron poros en las membranas plasmáticas de las células HeLa, según lo determinado por la fuga de potasio y LDH de las células, la activación de la respuesta al estrés MAPK, los cambios en la forma celular y el citoesqueleto y la inducción de la citólisis. Estas observaciones son típicas de los efectos de las toxinas formadoras de poros en las células1,2,7,15,34. Sin embargo, descubrimos que el tratamiento de las células HeLa con dexametasona o hidrocortisona redujo la fuga de potasio y LDH inducida por citolisina, evitó la fosforilación de ERK, p38 y JNK inducida por piolisina, limitó los cambios citoesqueléticos y evitó la citólisis. Utilizando nuestros datos de fuga de LDH, estimamos que la CE50 es dexametasona de 0,09 µM para la protección de las células HeLa contra la piolisina. El nivel de citoprotección fue sorprendente: la dexametasona 10 µM proporcionó > 90 % de protección.

La citoprotección con glucocorticoides contra la piolisina se extendió a varios tipos de células tisulares, pero el nivel de citoprotección varió entre los tipos de células. Esta variación en la citoprotección podría reflejar diferencias en las respuestas a los glucocorticoides, que a menudo son específicas del tipo de célula y del contexto24,25,26,27. Alternativamente, la variación en la citoprotección podría reflejar diferencias en la sensibilidad celular a la piolisina, que se ha observado previamente entre diferentes líneas celulares y entre células epiteliales y estromales10,36. También encontramos diferencias en la citoprotección entre las citolisinas dependientes del colesterol y la α-hemolisina, lo que puede reflejar el diámetro diez veces menor de los poros de la α-hemolisina14,18.

Protección implica defender o protegerse contra ataques, lesiones o daños. Mientras que la reparación abarca el reemplazo o reparación de estructuras dañadas, desgastadas o defectuosas. Los mecanismos de reparación reconocidos para las células dañadas por las toxinas formadoras de poros incluyen la endocitosis, la exocitosis, la MAPK, la respuesta de la proteína desplegada y la actividad caspasa2,15,22,35. Estos mecanismos generalmente se inician con la salida de potasio o la entrada de calcio, pero la citoprotección con glucocorticoides no dependió de las concentraciones de potasio o calcio en el presente estudio. Además, los glucocorticoides suprimen la fosforilación de MAPK;25,39 mientras que la activación de MAPK se asocia con la reducción del daño causado por las toxinas formadoras de poros15,34,35. De acuerdo con que los glucocorticoides estimulan la formación de fibras de estrés de actina y estabilizan el citoesqueleto44, también observamos que los glucocorticoides estimulan la formación de fibras de estrés de actina en las células HeLa y A549. Estos cambios podrían limitar los cambios citoesqueléticos inducidos por la citolisina; aunque no está claro cómo esto limitaría la fuga de potasio o LDH. De hecho, una característica notable fue que la piolisina se unía a las células, pero el tratamiento con dexametasona parecía limitar la formación de poros, según lo determinado por la fuga de potasio o LDH. La capacidad del tratamiento con glucocorticoides para limitar la fuga de potasio inducida por la citolisina implica que se previnieron las primeras etapas de formación de poros, así como las etapas posteriores de daño de la membrana y citólisis, que se evidenció por la fuga de LDH.

La citoprotección de la dexametasona contra la piolisina fue inesperada porque los glucocorticoides no son agentes reductores del colesterol reconocidos, a diferencia de las estatinas, interferones, oxiesteroles o ciclodextrinas, que se han utilizado para limitar el daño celular o la unión de las citolisinas dependientes del colesterol10,11,12,19,29. 37,45. Hay una reserva de colesterol lábil accesible a las citolisinas dependientes del colesterol cuando el colesterol comprende > 35% en moles de los lípidos de membrana11,12,37. Los cambios en la síntesis, absorción, salida o metabolismo del colesterol alteran la capacidad de las citolisinas dependientes del colesterol para unirse a las células. Sin embargo, en el presente estudio, encontramos que los glucocorticoides no redujeron el colesterol celular total ni el conjunto accesible de colesterol de la membrana plasmática. Estos hallazgos concuerdan con observaciones previas de que la dexametasona estimula la síntesis de colesterol y suprime la salida de colesterol celular46. Aunque la dexametasona puede estimular ACAT38, también encontramos que, a diferencia de los hidroxicolesteroles de cadena lateral37, los glucocorticoides no protegieron significativamente las células al aumentar la esterificación del colesterol. Por lo tanto, razonamos que es poco probable que la reducción del colesterol en la membrana plasmática sea un mecanismo para la citoprotección con glucocorticoides. Sin embargo, otros cambios en la membrana plasmática podrían impedir la formación de poros sin alterar el colesterol celular total. Curiosamente, el cortisol aumenta la fluidez de la membrana plasmática de los hepatocitos y altera el orden de las membranas en la trucha arco iris47. El empaquetamiento de los fosfolípidos en las membranas plasmáticas altera la distribución y accesibilidad del colesterol, y se puede aprovechar un empaquetamiento menos apretado de los fosfolípidos para promover la unión dependiente del colesterol48,49. Estos cambios en el orden de los lípidos también tienen efectos más amplios sobre la sensibilidad de las membranas al daño. Por ejemplo, un alto orden de lípidos en las células T asesinas ayuda a proteger la membrana plasmática contra daños al repeler la toxina formadora de poros del huésped, la perforina50.

Aunque los glucocorticoides pueden reprimir los factores de transcripción y tener efectos no genómicos rápidos, generalmente actúan uniéndose al receptor de glucocorticoides en el citosol24,25,26,27. Luego, el receptor se desplaza al núcleo y se une a elementos de respuesta a glucocorticoides que conducen a la transactivación o transrepresión de genes. Pensamos que era probable que el mecanismo de citoprotección fuera un efecto dependiente del receptor de glucocorticoides porque la citoprotección requería tratamiento con glucocorticoides durante ≥ 6 h, y la inhibición de la transcripción o traducción disminuía la citoprotección. El inhibidor del receptor de glucocorticoides RU486 también disminuyó la citoprotección con dexametasona. Una preocupación podría ser que RU486 también tenga actividad antiprogestina, pero las células HeLa no expresan el receptor de progesterona51. Además, el uso de ARNip dirigido a NR3C1 para reducir la proteína del receptor de glucocorticoides disminuyó la citoprotección de la dexametasona. En conjunto, estos hallazgos proporcionan evidencia de que la citoprotección de los glucocorticoides contra las toxinas formadoras de poros dependía del receptor de glucocorticoides.

Los glucocorticoides se utilizan como terapia complementaria para algunas infecciones bacterianas porque reducen la inflamación y la inmunopatología6,24,25. Nuestros hallazgos implican que los glucocorticoides también podrían proteger profilácticamente contra el daño tisular causado por bacterias que secretan toxinas formadoras de poros. Un desafío futuro será desentrañar las funciones antiinflamatorias y protectoras de los glucocorticoides. Otro desafío es que los glucocorticoides también podrían haber alterado las respuestas de hambre en las células para afectar su susceptibilidad a las toxinas que forman los poros. No encontramos evidencia de que el tratamiento con glucocorticoides altere el número de células viables con o sin suero mediante ensayos de MTT, ensayos de ADN celular o citología. Sin embargo, nuestro inesperado hallazgo de que el cultivo de células con suero disminuía reversiblemente la citoprotección de los glucocorticoides inspiró una búsqueda de factores que están regulados de manera opuesta por el suero y los glucocorticoides. Aunque el suero y los glucocorticoides regulan una amplia gama de genes y vías25,26,30, pocos están regulados de manera diferencial. Un ejemplo fue que la expresión de HMGCR se reprime mediante el tratamiento con suero30, mientras que los glucocorticoides aumentan la actividad de HMGCR en las células HeLa43. Sorprendentemente, descubrimos que el uso de ARNip para agotar el HMGCR disminuyó la citoprotección de glucocorticoides contra la piolisina. La forma en que HMGCR vincula mecánicamente los glucocorticoides con la citoprotección merece una mayor investigación.

También es necesario investigar más a fondo si la citoprotección con glucocorticoides es evidente in vivo. Una posible limitación para traducir nuestros hallazgos es que, si bien el tratamiento con glucocorticoides a corto plazo es bien tolerado por los pacientes, el uso prolongado o altas dosis de glucocorticoides se asocian con efectos secundarios endocrinos o de inmunosupresión adversos25. Esto ha llevado al desarrollo de agonistas selectivos de los receptores de glucocorticoides, como la fluticasona, con una alta afinidad por el receptor de glucocorticoides y acciones antiinflamatorias mejoradas28. Nuestros hallazgos ahora pueden estimular la búsqueda de agonistas selectivos de los receptores de glucocorticoides que también mejoren la citoprotección, lo que ayudaría a los pacientes a tolerar mejor los patógenos20.

En resumen, encontramos que el tratamiento con glucocorticoides protegía varios tipos de células contra las toxinas formadoras de poros. Los glucocorticoides aumentaron la protección intrínseca de las células HeLa y A549 contra el daño y la citolisis causados ​​por la piolisina, la estreptolisina O y la α-hemolisina. Esta citoprotección de glucocorticoides dependía del receptor de glucocorticoides. Nuestros hallazgos implican que los glucocorticoides podrían aprovecharse para ayudar a los tejidos a tolerar mejor la presencia de bacterias patógenas que secretan toxinas formadoras de poros.

Se cultivaron células HeLa epiteliales cervicales humanas (CCL2, 93021013; Colección europea de cultivos celulares autenticados (ECACC), Public Health England, Salisbury, Reino Unido) en medio completo que comprendía DMEM (Thermo Fisher Scientific, Paisley, Reino Unido), 10% de calor- suero bovino fetal inactivado (FBS, Biosera, East Sussex, Reino Unido), L-glutamina 2 mM (Thermo Fisher Scientific) y solución antibiótica y antimicótica al 1% (ABAM; Merck, Gillingham, Reino Unido). Se cultivaron células A549 epiteliales de pulmón humano (CCL-185; ATCC, Middlesex, Reino Unido) en medio completo que comprendía RPMI 1640, FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM (Thermo Fisher Scientific) y ABAM al 1 %. Se cultivaron células HepG2 epiteliales de hígado humano (HB-8065; ATCC) en medio completo que comprendía DMEM, FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM y ABAM al 1 %. Se cultivaron células epiteliales de pulmón humano NCI-H441 (HTB-174; ATCC) en medio completo que comprendía RPMI 1640, FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM y ABAM al 1 %.

Se obtuvieron fibroblastos dérmicos humanos normales primarios (C-12302; Promocell, Heidelberg, Alemania) de la dermis de piel adulta normal. Las células se cultivaron en medio de crecimiento de fibroblastos 2 con mezcla suplementaria (Promocell). Los fibroblastos de pulmón humano normal primario se obtuvieron de parénquima pulmonar humano sano normal (HLF, PCS-201-013; ATCC). Las células se cultivaron en medio completo que comprendía DMEM bajo en glucosa (Thermo Fisher Scientific), FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM y ABAM al 1 %.

Se aislaron células PNT2 de próstata humana normal (95012613; ECACC) de un individuo normal y se inmortalizaron con SV40. Se aislaron células MET5A mesoteliales humanas normales (CRL-9444; ATCC) de fluidos pleurales obtenidos de individuos no cancerosos y se inmortalizaron con el plásmido pRSV-T. Ambas células se cultivaron en medio completo que comprendía RPMI 1640, FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM y ABAM al 1 %.

Se aislaron condrocitos humanos primarios adultos a partir de tejido quirúrgico nasoseptal residual recolectado con el consentimiento informado de donantes sanos sometidos a septorrinoplastia en los hospitales Singleton y Morriston, Swansea, Reino Unido, con la aprobación de la Junta de Salud de la Universidad de Swansea Bay (IRAS ID 99202). Los condrocitos humanos primarios se aislaron mediante digestión secuencial de tejido de cartílago nasoseptal con pronasa al 0,2% (p/v) (Merck) durante 40 minutos seguido de solución de colagenasa al 0,24% (p/v) (Merck) durante 16 h52. Las células se cultivaron en medio completo que comprendía DMEM, FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, D-glucosa 1 mM, MEM NEAA al 0,1 % (Merck) y ABAM al 1 %.

Se aislaron células epiteliales endometriales bovinas primarias de tractos genitales femeninos normales recolectados de ganado después de su sacrificio durante el trabajo normal de un matadero comercial, con la aprobación del Departamento de Medio Ambiente, Alimentación y Asuntos Rurales del Reino Unido según la regulación sobre subproductos animales ( CE) No. 1069/2009 (número de registro U1268379/ABP/OTROS). Brevemente, se aislaron células epiteliales diseccionando el endometrio e incubando tejido cortado durante 1 hora a 37°C con agitación suave en una solución digestiva (375 unidades BAEE de ácido tripsina etilendiaminotetraacético, 50 mg de colagenasa II, 100 mg de albúmina sérica bovina (BSA ) y 10 mg de DNasa I en 100 ml de solución salina equilibrada de Hanks; todo Merck)10. La suspensión celular resultante se tamizó a través de una malla de 40 μm (Cambridge Bioscience, Cambridge, Reino Unido) y luego se recogieron las células epiteliales mediante retrolavado de la malla. Las células epiteliales endometriales se cultivaron en medio completo que comprendía RPMI 1640, FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM y ABAM al 1 %.

Las células se cultivaron en matraces de 75 cm2 (Greiner Bio-One) a 37,5 °C en aire humidificado con 5% de dióxido de carbono y el medio se reponía cada 48 a 72 h. Para los experimentos, las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (TPP, Trasadingen, Suiza), utilizando 1 ml/pocillo de medio completo, y se cultivaron hasta un 70 % de confluencia.

Se generó proteína piolisina (628.338 HU/mg de proteína) y se purificó a partir del plásmido plo pGS5910,13. La estreptolisina O se almacenó como una solución de 1 mg/ml y se activó con ditiotreitol 10 mM, y la α-hemolisina de Staphylococcus aureus se almacenó como una solución de 0,5 mg/ml según las instrucciones del fabricante (todo Merck).

Las concentraciones de exposición a piolisina se determinaron cultivando células durante 24 h en medio sin suero y luego provocando 12,5–400 HU de piolisina en 200 µl/pocillo de PBS de Dulbecco (DPBS, Thermo Fisher Scientific) durante 15 minutos, que luego se complementó con 400 µl. /pozo medio libre de suero durante 1 h 45 min. Al final del período de exposición, se recogieron los sobrenadantes para medir la fuga de LDH y se midió la viabilidad celular mediante un ensayo MTT.

Para examinar si los glucocorticoides protegían a las células contra la piolisina, las células se incubaron en medios sin suero que contenían un vehículo DMSO al 0,1% o el rango de concentraciones especificado en Resultados de dexametasona (#D4902; Merck), hidrocortisona (#H0888; Merck) o propionato de fluticasona. (#2007; Tocris, Abingdon, Reino Unido), que se basaron en las instrucciones y publicaciones de los fabricantes28,53,54. El período de tratamiento de 24 h se basó en trabajos que investigaban la citoprotección;10,19,31 excepto en los experimentos que exploraban la duración del tratamiento con glucocorticoides requerido para proteger las células contra las toxinas formadoras de poros, donde las células HeLa se trataron con dexametasona o hidrocortisona 10 µM durante un rango de veces hasta 24 h. Después del período de tratamiento, se descartaron los sobrenadantes y las células se expusieron a control o piolisina como se especifica en Resultados. Para determinar si la citoprotección se extendía más allá de la piolisina, las células HeLa y A549 se trataron con dexametasona durante 24 h y luego se expusieron a control o estreptolisina O durante 2 h, o α-hemolisina durante 24 h, como se especifica en los Resultados. El rango de concentración de desafío de α-hemolisina se basó en trabajos previos32, y la duración de 24 h se seleccionó después de experimentos preliminares. Al final de los períodos de exposición, se recogieron sobrenadantes para medir la fuga de LDH y se evaluó la viabilidad celular mediante un ensayo MTT o se capturaron micrografías de luz transmitida utilizando una cámara microscópica Axiocam ERc 5s (Zeiss), y se determinó la proporción de células normales, con ampollas y Las células fragmentadas se contaron utilizando dos imágenes independientes por réplica de tratamiento.

Para explorar los efectos del tratamiento con glucocorticoides sobre la señalización MAPK inducida por piolisina, se sembraron células HeLa a razón de 1,5 x 105 células por pocillo en placas de 6 pocillos en medio completo durante 24 h, luego se trataron con medio sin suero o con medio que contenía dexametasona 10 µM. , hidrocortisona 10 µM o metil-β-ciclodextrina 1 mM (Merck) durante 24 h, y luego se expusieron a un medio control sin suero o a un medio que contenía 100 HU/pocillo de piolisina durante 10 min. y MAPK evaluado mediante transferencia Western (ver más abajo).

Para examinar el efecto del potasio sobre la citoprotección, se cultivaron células HeLa durante 24 h en un medio que contenía vehículo o dexametasona 10 µM, las células se lavaron dos veces con tampón y luego se expusieron a 100 HU/pocillo de piolisina en 200 µl/pocillo de bajo contenido de potasio. tampón (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 1,3 mM, MgCl2 0,5 mM, K2HPO4 0,36 mM, KH2PO4 0,44 mM, D-glucosa 5,5 mM, NaHCO3 4,2 mM) o tampón con alto contenido de potasio (NaCl 5 mM, KCl 140 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 1,3 mM, MgCl2 0,5 mM, K2HPO4 0,36 mM, KH2PO4 0,44 mM, D-glucosa 5,5 mM, NaHCO3 4,2 mM) durante 2 h21. Para examinar el efecto del calcio sobre la citoprotección, se cultivaron células HeLa durante 24 h en un medio que contenía vehículo o dexametasona 10 µM, las células se lavaron dos veces con DPBS sin calcio y luego se expusieron a 100 HU/pocillo de piolisina en 200 µl/pocillo. DPBS libre de calcio o que contiene calcio durante 15 min, suplementado con 400 µl de medio libre de suero con o sin calcio durante 1 h 45 min. Se recogieron sobrenadantes para medir la fuga de LDH y se midió la viabilidad celular mediante un ensayo MTT.

Para examinar el papel de ACAT en la citoprotección de glucocorticoides contra piolisina utilizamos el inhibidor selectivo de ACAT Sandoz 58-035 (SZ58-035, Merck)37,55. Las células HeLa se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, Thermo Fisher Scientific) y luego se cultivaron con vehículo DMSO al 0,1% o SZ5-035 10 µM en medio de cultivo sin suero. Después de una incubación de 16 h, las células se lavaron dos veces con PBS y luego se incubaron durante 24 h en medio de cultivo sin suero que contenía 27-hidroxicolesterol 10 ng/ml (Avanti Polar Lipids, Alabama, Estados Unidos) o dexametasona 10 µM, en combinación con vehículo o 10 µM SZ5-035. Las células se expusieron a control o piolisina durante 2 h, y luego se recogieron los sobrenadantes para medir la fuga de LDH y se midió la viabilidad celular mediante un ensayo de MTT.

Para investigar el efecto del tratamiento con glucocorticoides sobre la abundancia de piolisina unida a membrana, se sembraron células HeLa a razón de 1,5 x 105 células/pocillo en placas de 6 pocillos en medio completo durante 24 h, y luego se trataron en medio sin suero o en medio que contenía Dexametasona 10 µM, hidrocortisona 10 µM, T0901317 50 nM, 27 hidroxicolesterol 10 ng/ml o metil-β-ciclodextrina 1 mM durante 24 h, y luego se expuso a un medio sin suero de control o a un medio que contenía 100 HU/pocillo de piolisina durante 2 h. y unión de piolisina determinada mediante transferencia Western.

Para explorar el efecto del suero sobre la citoprotección, las células HeLa se trataron con dexametasona en un medio que contenía FBS inactivado por calor o FBS inactivado por calor despojado de carbón durante los períodos especificados en los Resultados. Para investigar si los efectos del suero sobre la citoprotección eran reversibles, las células se trataron con dexametasona 10 µM en medio con o sin FBS al 10 %, y luego, en un intervalo de tiempo de 1 a 24 h, se descartaron los sobrenadantes y las células se lavaron dos veces con PBS. , y el medio cambió a medio libre de suero durante el resto del período de 24 h, antes de que las células fueran expuestas a control o piolisina durante 2 h, y se midió la viabilidad celular utilizando un ensayo MTT.

Para examinar el papel del receptor de glucocorticoides en la citoprotección, utilizamos los inhibidores actinomicina D, cicloheximida y RU486 (todos Merck). Las células se incubaron en medio libre de suero con vehículo, dexametasona 10 µM o hidrocortisona 10 µM, en combinación con disolvente DMSO al 0,1%, RU486 10 µM o cicloheximida 1 µg/ml como se especifica en Resultados. Alternativamente, las células se trataron con disolvente DMSO al 0,15 % o actinomicina D 0,25 µg/ml durante 2 h, luego se trataron con las combinaciones de vehículo, dexametasona 10 µM y actinomicina D durante 24 h como se especifica en Resultados. Se descartaron los sobrenadantes, las células se expusieron a control o piolisina durante 2 h, se recogieron los sobrenadantes para medir la fuga de LDH y se midió la viabilidad celular mediante un ensayo de MTT.

Para examinar el papel del receptor de glucocorticoides y HMGCR en la citoprotección, se utilizó ARNip para anular la expresión de NR3C1 o HMGCR, respectivamente. Las células se transfectaron con ARNip no dirigidos ON-TARGET Plus codificados (#D-001810-0X; Horizon Discovery, Cambridge, Reino Unido), ARNip del grupo ON-TARGET Plus SMART dirigidos a NR3C1 (L-003424-00-0005; descubrimiento Horizon) , o ARNip diseñado con Dharmacon siDesign Center para apuntar a HMGCR (sentido, GGAUAAACCGAGAAAGAAAUU; antisentido, UUUCUUUCUCGGUUUAUCC). En placas de cultivo de 24 pocillos, se agregaron 50 pmol de ARNip a 100 µl/pocillo de medio Opti-MEM 1 con 1,5 µl de reactivo Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego se sembraron células HeLa con 4 x 104 células en 900 µl de medio DMEM con FBS al 10% durante 48 h. Luego, las células se trataron con vehículo, dexametasona 10 µM o hidrocortisona 10 µM durante 24 h en medio de cultivo sin suero antes de una exposición de 2 h con medio de control o medio que contenía 100 HU de piolisina. Al final del período de exposición, se recogieron los sobrenadantes para medir la fuga de LDH y se evaluó la viabilidad celular mediante ensayos de MTT.

La viabilidad de las células se evaluó mediante la reducción dependiente de las mitocondrias del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT, Merck)10,56. Las células se incubaron en 250 µl/pocillo de medio de cultivo sin suero que contenía 1 mg/ml de MTT durante 2 h. Luego se descartó el medio y las células se lisaron con 300 µl/pocillo de dimetilsulfóxido (Merck). La densidad óptica (OD570) se midió utilizando un lector de microplacas POLARstar Omega (POLARstar Omega; BMG, Labtech, Offenburg, Alemania). La viabilidad de los fibroblastos dérmicos se evaluó cuantificando el ADN celular utilizando el kit de ensayo de proliferación celular CyQUANT (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La actividad de la lactato deshidrogenasa se cuantificó midiendo la conversión de lactato en piruvato dependiente de LDH, mediante la reducción de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) a NADH, que se detecta mediante la reducción dependiente de NADH de una sal de tetrazolio a formazán17. Brevemente, se agregaron 0–20 nmol/pocillo de estándar de NADH (Merck) o 20 µl/pocillo de sobrenadante celular a 30 µl/pocillo de tampón de ensayo (clorhidrato de Tris 0,2 M, pH 8,2, Merck) por duplicado en placas transparentes de media área de 96 pocillos. (Greiner). Se preparó una mezcla de reacción (L-lactato de sodio 54 mM, cloruro de 2-p-yodofenil-3-p-nitrofeniltetrazolio 0,66 mM, metosulfato de fenazina 0,28 mM y NAD+ 1,3 mM; todo Merck) en tampón de ensayo, y se añadieron 50 µl a cada pozo. La densidad óptica a 570 nm se midió inmediatamente (A0) y después de 30 minutos de incubación a 37,5°C (A30), utilizando un lector de placas POLARstar Omega. La diferencia en la densidad óptica del sobrenadante (A30 - A0) se usó para calcular la cantidad de NADH generada a partir de los estándares de NADH. Luego se calculó la actividad de LDH sobrenadante en mU/ml como: actividad de LDH = nmol de NADH / (tiempo de reacción de 30 min x 0,02 ml de volumen de sobrenadante). Los coeficientes de variación inter e intraensayo fueron <8% y <5%, respectivamente.

Para cuantificar la fuga de potasio, se sembraron células en medio completo a 1,5 x 105 células por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h, antes del tratamiento con vehículo, dexametasona 10 µM o hidrocortisona 10 µM en medio sin suero durante 24 h. Se descartaron los sobrenadantes y las células se lavaron 3 veces con tampón de colina libre de potasio (colina-Cl 129 mM, MgCl2 0,8 mM, CaCl2 1,5 mM, ácido cítrico 5 mM, glucosa 5,6 mM, NH4Cl 10 mM, H3PO4 5 mM, pH 7.4; todo Merck), y luego se expusieron a tampón de colina, piolisina o estreptolisina O durante 5 minutos, o con 8 µg/5 × 104 células de α-hemolisina durante 15 minutos (no se detectó fuga de potasio en las células HeLa después de 5 minutos de α -desafío de hemolisina). Luego, las células se lavaron 3 veces en tampón de colina enfriado con hielo y se lisaron en Triton X-100 al 0,5% (Merck) en agua destilada durante 20 minutos en un balancín a temperatura ambiente. El potasio se midió en sobrenadantes y lisados ​​utilizando un fotómetro de llama Jenway PFP7 (Cole-Parmer, Stone, Staffordshire, Reino Unido). Los coeficientes de variación inter e intraensayo fueron <4%.

Para cuantificar el colesterol celular en células HeLa y A549, se sembraron 1,5 x 105 células por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos en medio completo durante 24 h. Las células se trataron en medio libre de suero durante 24 h más con vehículo, dexametasona 10 µM, hidrocortisona 10 µM o metil-β-ciclodextrina 1 mM, antes de que las células se lavaran dos veces con PBS y se recogieran en 200 µl/pocillo de tampón de ensayo de colesterol. (Thermo Fisher Scientific) y almacenado a -20°C. El colesterol celular se midió utilizando el kit de ensayo de colesterol rojo Amplex (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el ensayo utiliza colesterol esterasa de Pseudomonas para hidrolizar ésteres de colesterol antes de que la colesterol oxidasa de Streptomyces oxide el colesterol celular para producir peróxido de hidrógeno y colestenona. El reactivo Amplex Red reacciona con peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa de rábano picante para producir resorufina fluorescente. La fluorescencia se midió mediante un lector de microplacas POLARstar Omega utilizando excitación de 530 nm y emisión de 590 nm. La abundancia de proteínas se midió en muestras utilizando un ensayo de proteínas DC (Bio-Rad, Hercules, CA, Estados Unidos) y las concentraciones de colesterol se normalizaron con respecto a la proteína celular total. Los coeficientes de variación inter e intraensayo para el ensayo fueron < 6 % y < 5 % respectivamente.

Para examinar la distribución de los filamentos de actina, las células se tiñeron con faloidina conjugada con Alexa Fluor 555 (Thermo Fisher Scientific)16. Se sembraron cubreobjetos de vidrio con 4 x 104 células por pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos en medio completo durante 24 h, antes del tratamiento en medio libre de suero con vehículo, dexametasona 10 µM o hidrocortisona 10 µM durante 24 h. Se descartaron los sobrenadantes y las células se expusieron a control o piolisina durante 2 h, o α-hemolisina durante 24 h. Al final del período de exposición, las células se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% (Merck), se lavaron en PBS y luego se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,2%. Las células se bloquearon durante 30 minutos en PBS que contenía albúmina sérica bovina al 0,5% y Triton X-100 al 0,1%, y luego se incubaron durante 1 h con faloidina conjugada con Alexa Fluor 555 (Thermo Fisher Scientific). Las células se lavaron con Triton X-100 al 0,1% en PBS 3 veces y se montaron en portaobjetos de microscopio usando 40,6 diamidino-2-fenilindol para visualizar los núcleos celulares (Vectashield con DAPI; Vector Laboratories Inc., Burlington, CA, EE. UU.). Las células se examinaron utilizando un microscopio de fluorescencia Axio Imager M1 y las imágenes se capturaron utilizando un AxioCamMR3 (Zeiss). La proporción de células que tuvieron cambios citoesqueléticos (contracción citoesquelética, forma alterada o pérdida de definición de la fibra de actina) después de la exposición a piolisina se contó utilizando > 135 células por tratamiento en 3 imágenes independientes por réplica.

Para investigar más a fondo los cambios en la forma de las células, las células se tiñeron con la tinción de membrana plasmática CellMask Deep Red (Thermo Fisher Scientific). Brevemente, se cultivaron 4 x 104 células HeLa por pocillo en cubreobjetos de vidrio en placas de cultivo de 24 pocillos en medio completo durante 24 h, luego se trataron en medio sin suero que contenía vehículo o dexametasona 10 µM durante 24 h. Se descartaron los sobrenadantes y las células se expusieron a control o piolisina durante 2 h. Al final del período de exposición, las células se lavaron con PBS, se incubaron con CellMask Deep Red durante 10 minutos a 37 °C, se lavaron nuevamente con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4 %. Se montaron cubreobjetos en portaobjetos de microscopio usando 40,6 diamidino-2-fenilindol para visualizar los núcleos celulares, y las células se examinaron usando un microscopio de fluorescencia Axio Imager M1 y las imágenes se capturaron usando un AxioCamMR3.

Al final de los experimentos, se descartaron los sobrenadantes, las células se lavaron con 300 µl de PBS enfriado con hielo y se lisaron con 100 µl de reactivo de extracción PhosphoSafe (Novagen, Darmstadt, Alemania) para el posterior aislamiento de proteínas y transferencia Western31. La proteína se extrajo y se cuantificó mediante un ensayo de CC, y se separaron 10 µg/carril de proteína mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10 % (vol/vol). Luego, las proteínas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (GE Healthcare, Chalfont, St Giles, Reino Unido) y se bloquearon durante 1 h en solución salina tamponada con Tris Tween 20 (TBST, Merck) con BSA al 5%. Luego, las membranas se incubaron durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios diluidos 1:1000 (o como se especifica) en tampón de bloqueo. Los anticuerpos primarios fueron ERK1/2 difosforilado (RRID: AB_477245; Merck), ERK1/2 (RRID: AB_2297336; Abcam, Cambridge, Reino Unido), fosfo-p38 (RRID: AB_2139682, Cell Signaling, Danvers, MA, EE. UU.), p38 (RRID: AB_10999090, Señalización celular), fosfo-JNK (RRID:AB_331659; Señalización celular), JNK (RRID: AB_2250373; Señalización celular), anticuerpo α His piolisina13 (dilución 1:500), receptor de glucocorticoides (RRID: AB_2631286, Cell Signaling), HMGCR (RRID: AB_2749818, Abcam, Cambridge, Reino Unido) o α-tubulina (RRID: AB_2210548; Cell Signaling). Luego, las membranas se lavaron 5 veces en TBST y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con IgG anti-conejo de dilución 1:2500 (RRID:AB_2099233; Cell Signalling) o IgG anti-ratón (RRID:AB_330924; Cell Signalling) en TBST con 5 % ASC. Las membranas se lavaron 5 veces más en TBST y la reactividad de las proteínas se visualizó utilizando quimioluminiscencia mejorada (sustrato Clarity Western ECL, Bio-Rad). Se capturaron imágenes de membrana (Figura 10 complementaria) utilizando un sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad), y la densidad máxima promedio de las bandas se cuantificó y normalizó a α-tubulina usando Fiji57.

La unidad estadística fue cada pase independiente de células. Los datos se informan como media aritmética ± sem y se atribuye significancia cuando P <0,05. El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 9.0.1 (GraphPad Software, San Diego, California, EE. UU.) y SPSS versión 26.0 (IBM, Armonk, NY, EE. UU.). Las comparaciones entre tratamientos se realizaron mediante ANOVA, seguido de pruebas post hoc para comparaciones múltiples como se especifica en Resultados. Las proporciones se compararon mediante la prueba de Chi-cuadrado.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio, y las transferencias Western no recortadas, se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria. Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en Datos complementarios 1. Todos los demás datos están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Dal Peraro, M. & van der Goot, FG Toxinas formadoras de poros: antiguas, pero nunca pasadas de moda. Nat. Rev. Microbiol 14, 77–92 (2016).

Artículo PubMed Google Scholar

Los, FC, Randis, TM, Aroian, RV y Ratner, AJ Papel de las toxinas formadoras de poros en las enfermedades infecciosas bacterianas. Microbiol mol. Biol. Rev. 77, 173–207 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

de Cassan, S. et al. Corticosteroides como tratamiento independiente o complementario para el dolor de garganta. Sistema de base de datos Cochrane. Rev.5, Cd008268 (2020).

PubMed Google Académico

Ghoneim, HE & McCullers, JA La terapia complementaria con corticosteroides mejora la inmunopatología pulmonar y la supervivencia durante la neumonía neumocócica secundaria grave en ratones. J. Infectar. Dis. 209, 1459-1468 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Stern, A. y col. Corticosteroides para la neumonía. Sistema de base de datos Cochrane. Rev.12, Cd007720 (2017).

PubMed Google Académico

Cain, DW y Cidlowski, JA Regulación inmune por glucocorticoides. Nat. Rev. Immunol. 17, 233–247 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Seilie, ES y Bubeck Wardenburg, J. Toxinas formadoras de poros de Staphylococcus aureus: la interfaz entre el patógeno y la complejidad del huésped. Desarrollo de células Semin. Biol. 72, 101-116 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jost, BH y Billington, SJ Arcanobacterium pyogenes: patogénesis molecular de un animal oportunista. Antonio Van. Leeuwenhoek 88, 87-102 (2005).

Artículo PubMed Google Scholar

Bhakdi, S., Tranumjensen, J. & Sziegoleit, A. Mecanismo de daño de la membrana por estreptolisina-O. Infectar. Inmune. 47, 52–60 (1985).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Amós, MR et al. La sensibilidad diferencial de las células endometriales a una citolisina dependiente del colesterol vincula a Trueperella pyogenes con la enfermedad uterina en el ganado. Biol. Reproducción. 90, 54 (2014).

Artículo PubMed Google Scholar

Das, A., Goldstein, JL, Anderson, DD, Brown, MS y Radhakrishnan, A. Uso de 125I-perfringolisina O mutante para investigar el transporte y la organización del colesterol en las membranas de las células animales. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 110, 10580–10585 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Das, A., Brown, MS, Anderson, DD, Goldstein, JL y Radhakrishnan, A. Tres grupos de colesterol de la membrana plasmática y su relación con la homeostasis del colesterol. Elife 3, 02881–02816 (2014).

Artículo de Google Scholar

Billington, SJ, Jost, BH, Cuevas, WA, Bright, KR y Songer, JG La hemolisina de Arcanobacterium (Actinomyces) pyogenes, piolisina, es un nuevo miembro de la familia de las citolisinas activadas por tiol. J. Bacteriol. 179, 6100–6106 (1997).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Preta, G. y col. Membranas bicapa unidas como herramienta complementaria para estudios funcionales y estructurales: el caso de la piolisina. Biochim Biophys. Actas 1858, 2070-2080 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

González, MR et al. Las toxinas formadoras de poros inducen múltiples respuestas celulares que promueven la supervivencia. Microbiol celular 13, 1026–1043 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Turner, ML, Owens, SE y Sheldon, IM La glutamina apoya la protección de las células de los tejidos contra el daño causado por las citolisinas dependientes del colesterol de las bacterias patógenas. PLoS One 15, e0219275 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pospiech, M. et al. Los inhibidores de bisfosfonatos de la escualeno sintasa protegen las células contra las citolisinas dependientes del colesterol. FASEB J. 35, e21640 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Canción, L. et al. Estructura de la alfa-hemolisina estafilocócica, un poro transmembrana heptamérico. Ciencia 274, 1859–1866 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Statt, S. y col. Las estatinas confieren mayor resistencia celular contra las toxinas bacterianas que forman poros en las células epiteliales de las vías respiratorias. Soy. J. Respirar. Molino celular. 53, 689–702 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Medzhitov, R., Schneider, DS & Soares, MP La tolerancia a las enfermedades como estrategia de defensa. Ciencia 335, 936–941 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gurcel, L., Abrami, L., Girardin, S., Tschopp, J. & van der Goot, FG La activación de caspasa-1 de las vías metabólicas de los lípidos en respuesta a las toxinas bacterianas que forman poros promueve la supervivencia celular. Celda 126, 1135-1145 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Andrews, NW y Corrotte, M. Reparación de membrana plasmática. actual. Biol. 28, R392–R397 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Brito, C., Cabanes, D., Sarmento Mesquita, F. y Sousa, S. Mecanismos que protegen las células huésped contra las toxinas bacterianas que forman poros. Molino celular. Ciencias de la vida. 76, 1319-1339 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kadmiel, M. & Cidlowski, JA Señalización del receptor de glucocorticoides en la salud y la enfermedad. Farmacéutica de tendencias. Ciencia. 34, 518–530 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Newton, R. Glucocorticoides antiinflamatorios: conceptos cambiantes. EUR. J. Farmacéutica. 724, 231–236 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Wang, JC y cols. La exploración por inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) identifica genes diana del receptor de glucocorticoides primarios. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 101, 15603–15608 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weikum, ER, Knuesel, MT, Ortlund, EA y Yamamoto, KR Control de la transcripción del receptor de glucocorticoides: precisión y plasticidad mediante alosterio. Nat. Rev. Mol. Biol celular. 18, 159-174 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Johnson, M. Desarrollo del propionato de fluticasona y comparación con otros corticosteroides inhalados. J. Clínica de Alergia. Inmunol. 101, S434–S439 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Preta, G., Lotti, V., Cronin, JG y Sheldon, IM Papel protector del inhibidor de dinamina Dynasore contra la citolisina dependiente del colesterol de Trueperella pyogenes. FASEB J. 29, 1516-1528 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Iyer, VR y cols. El programa transcripcional en la respuesta de los fibroblastos humanos al suero. Ciencia 283, 83–87 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Griffin, S., Healey, GD y Sheldon, IM Los isoprenoides aumentan la tolerancia de las células del estroma endometrial bovino a la citolisina dependiente del colesterol de Trueperella pyogenes. Biol. Reproducción. 99, 749–760 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Mestre, MB, Fader, CM, Sola, C. & Colombo, MI La alfa-hemolisina es necesaria para la activación de la vía autofágica en células infectadas por Staphylococcus aureus. Autofagia 6, 110-125 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kao, CY et al. Análisis funcionales globales de las respuestas celulares a las toxinas formadoras de poros. PLoS Ruta 7, e1001314 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

Kloft, N. y col. Las toxinas formadoras de poros activan MAPK p38 provocando la pérdida de potasio celular. Bioquímica Biofísica. Res Común. 385, 503–506 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cassidy, SK & O'Riordan, MX Más que un poro: la respuesta celular a las citolisinas dependientes del colesterol. Toxinas (Basilea) 5, 618–636 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ormsby, TJR y cols. Los oxiesteroles protegen las células epiteliales contra las toxinas que forman los poros. Inmunol frontal. 13, 815775 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Abrams, ME y cols. Los oxiesteroles proporcionan inmunidad innata a las infecciones bacterianas al movilizar el colesterol accesible a la superficie celular. Nat. Microbiol 5, 929–942 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Petrichenko, IE, Daret, D., Kolpakova, GV, Shakhov, YA y Larrue, J. Los glucocorticoides estimulan la formación de ésteres de colesterilo en células del músculo liso humano. Trombo arterioescler. Vasc. Biol. 17, 1143-1151 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Troppmair, J. y col. La activación de la proteína quinasa activada por mitógenos/proteína quinasa regulada por señales extracelulares mediante oncogenes, suero y 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato requiere Raf y es necesaria para la transformación. J. Biol. Química. 269, 7030–7035 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cao, Z. y col. Efectos del tratamiento con resina o carbón sobre el suero fetal bovino y suero bovino de ternera. Endocr. Res 34, 101–108 (2009).

Artículo PubMed Google Scholar

Cadepond, F., Ulmann, A. y Baulieu, E.-E. RU486 (mifepristona): mecanismos de acción y usos clínicos. Annu Rev. Med 48, 129-156 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Goldstein, JL & Brown, MS Regulación de la vía del mevalonato. Naturaleza 343, 425–430 (1990).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cavenee, WK y Melnykovych, G. Inducción de 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa en células HeLa mediante glucocorticoides. J. Biol. Química. 252, 3272–3276 (1977).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mayanagi, T., Morita, T., Hayashi, K., Fukumoto, K. y Sobue, K. La expresión de caldesmon mediada por receptores de glucocorticoides regula la migración celular mediante la reorganización del citoesqueleto de actina. J. Biol. Química. 283, 31183–31196 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, QD y cols. Reprogramación del colesterol de membrana mediada por interferón para evadir las toxinas bacterianas. Nat. Inmunol. 21, 746–755 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ayaori, M. et al. El receptor de glucocorticoides regula la expresión del transportador A1 del casete de unión a ATP y la salida de colesterol mediada por apolipoproteínas desde los macrófagos. Trombo arterioescler. Vasc. Biol. 26, 163–168 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dindia, L. et al. La nueva señalización no genómica de los glucocorticoides puede implicar cambios en el orden de la membrana hepática en la trucha arco iris. Más UNO 7, e46859 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nelson, LD, Johnson, AE y London, E. Cómo la interacción de la perfringolisina O con las membranas está controlada por la estructura de los esteroles, la estructura de los lípidos y el pH fisiológico bajo: conocimientos sobre el origen de la interacción entre la perfringolisina O y la balsa lipídica. J. Biol. Química. 283, 4632–4642 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Farrand, AJ y cols. La interfaz de unión a la membrana de la citolisina dependiente del colesterol discrimina los entornos lipídicos del colesterol para favorecer la inserción de los poros del barril β. J. Biol. Química. 290, 17733–17744 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rudd-Schmidt, JA et al. El orden y la carga de los lípidos protegen a las células T asesinas de la muerte accidental. Nat. Comunitario. 10, 5396 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Mac Namara, P. & Loughrey, HC Expresión de isoformas A y B del receptor de progesterona en osteoblastos humanos. Calcif. Tejido Int 63, 39–46 (1998).

Artículo de Google Scholar

Oseni, AO, Butler, PE y Seifalian, AM Optimización del aislamiento y caracterización de condrocitos para la ingeniería de tejido cartilaginoso a gran escala. J. Cirugía. Res 181, 41–48 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Garside, H. y col. Los ligandos de glucocorticoides especifican diferentes interacciones con NF-κB mediante efectos alostéricos en el dominio de unión al ADN del receptor de glucocorticoides. J. Biol. Química. 279, 50050–50059 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Croxtall, JD, Van Hal, PTW, Choudhury, Q., Gilroy, DW y Flower, RJ Los diferentes glucocorticoides varían en su mecanismo de acción genómico y no genómico en las células A549. Hno. J. Farmacéutica. 135, 511–519 (2002).

Artículo CAS Google Scholar

Ross, AC, Go, KJ, Heider, JG y Rothblat, GH Inhibición selectiva de la acil coenzima A: colesterol aciltransferasa por el compuesto 58-035. J. Biol. Química. 259, 815–819 (1984).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mosmann, T. Ensayo colorimétrico rápido para el crecimiento y la supervivencia celular: aplicación a ensayos de proliferación y citotoxicidad. J. Inmunol. Métodos 65, 55–63 (1983).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Schindelin, J. y col. Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas. Nat. Métodos 9, 676–682 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Descargar referencias

Este estudio fue apoyado por el Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas (BB/K006592/1) y el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver de los Institutos Nacionales de Salud (R01HD084316). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. El plásmido plo (pGS59) y el anticuerpo piolisina fueron obsequios generosos de H Jost (Universidad de Arizona, EE. UU.). Agradecemos a I Whitaker por los condrocitos y a A Horlock y M Pospiech (Universidad de Swansea) por su asesoramiento técnico.

Facultad de Medicina de la Universidad de Swansea, Universidad de Swansea, Swansea, SA2 8PP, Reino Unido

Thomas JR Ormsby, Sian E. Owens, Matthew L. Turner, James G. Cronin y I. Martin Sheldon

Departamento de Ciencias Animales, Universidad de Florida, Gainesville, FL, 32611, EE. UU.

John J. Bromfield

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

Conceptualización, IMS, TO; metodología, IMS, TO, SEO, MLT; investigación TO, SEO, MLT; redacción – preparación del borrador original TO, IMS; redacción: revisión y edición de TO, SEO, MLT, JGC, JJB, IMS; visualización PARA, IMS; supervisión, IMS, JGC, JJB; administración de proyectos IMS; adquisición de financiación IMS, JJB

Correspondencia a I. Martin Sheldon.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Se aislaron condrocitos humanos primarios adultos a partir de tejido quirúrgico nasoseptal residual recolectado con el consentimiento informado de donantes sanos sometidos a septorrinoplastia en los hospitales Singleton y Morriston, Swansea, Reino Unido, con la aprobación de la Junta de Salud de la Universidad de Swansea Bay (IRAS ID 99202). Se aislaron células epiteliales endometriales bovinas primarias de los tractos genitales femeninos recolectados de ganado después de su sacrificio durante el trabajo normal de un matadero comercial, con la aprobación del Departamento de Medio Ambiente, Alimentación y Asuntos Rurales del Reino Unido según el reglamento sobre subproductos animales (CE). ) No. 1069/2009 (número de registro U1268379/ABP/OTROS).

Communications Biology agradece a Michelle Christie y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Jesmond Dalli y Eve Rogers.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Ormsby, TJR, Owens, SE, Turner, ML et al. Los glucocorticoides aumentan la protección de las células de los tejidos contra las toxinas que forman los poros provenientes de bacterias patógenas. Común Biol 6, 186 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04568-w

Descargar cita

Recibido: 15 de julio de 2021

Aceptado: 09 de febrero de 2023

Publicado: 17 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04568-w

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.