Estrategia para mejorar la eficacia de la doxorrubicina en células tumorales sólidas mediante metilo - Grupo de ciclodextrina nativa de Zhejiang

Scientific Reports volumen 5, número de artículo: 11853 (2015) Citar este artículo

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La doxorrubicina (DOX) es uno de los medicamentos preferidos para el tratamiento del cáncer de mama y de hígado. Sin embargo, su aplicación clínica es limitada debido a los graves efectos secundarios y la consiguiente resistencia a los medicamentos. En este contexto, investigamos el efecto sobre la eficacia terapéutica de DOX por el agente agotador del colesterol metil-β-ciclodextrina (MCD) y exploramos la participación de p53. MCD sensibiliza las células MCF-7 y Hepa1–6 a DOX. La combinación de MCD y una dosis marginal de DOX reduce la viabilidad celular y promueve la apoptosis mediante la inducción de la proteína proapoptótica, Bax, la activación de caspasa-8 y caspasa-7, regulación negativa. de la proteína antiapoptótica Bcl-2 y finalmente promoviendo la escisión de PARP. Mecánicamente, la sensibilización a DOX por MCD se debió a la inducción de la vía FasR/FasL a través de la activación de p53. Además, la inhibición de p53 por el inhibidor farmacológico pifitrin-α (PFT-α) o su ARNip específico atenuó la función de p53 y reguló negativamente FasR/FasL, previniendo así la muerte celular. Los experimentos con animales se realizaron utilizando un ratón C57BL/6J isoinjertado con células Hepa1–6. El crecimiento del tumor se retrasó y la supervivencia aumentó en ratones a los que se les administró MCD junto con DOX en comparación con cualquiera de los agentes solos. En conjunto, estos resultados sugieren que MCD mejora la sensibilidad a DOX para la cual p53 de tipo salvaje es un determinante importante.

El carcinoma de mama y hepatocelular (CHC) son el segundo y quinto cáncer más prevalentes, respectivamente, y las principales causas de muerte asociada al cáncer en todo el mundo1,2,3. Aunque la extirpación quirúrgica del tumor sigue siendo el tratamiento principal de elección, aparte de la cirugía o la radioterapia, la quimioterapia sigue siendo la forma más eficaz de prevenir el crecimiento de células cancerosas y la metástasis, mejorando así la supervivencia de los pacientes con cáncer4. Una de las principales limitaciones de los fármacos quimioterapéuticos es la toxicidad debida al régimen de dosis altas o a la eficacia inadecuada de los fármacos contra las células tumorales5. Por lo tanto, son urgentemente deseables nuevas estrategias para lograr una respuesta favorable a la quimioterapia para mejorar el pronóstico del cáncer de mama y de hígado.

La doxorrubicina (DOX), un antibiótico antraciclina, es uno de los agentes quimioterapéuticos más eficaces y ampliamente utilizados para el tratamiento de diversas neoplasias malignas, incluidas las de mama e hígado, durante los últimos veinte años6. Sin embargo, los inconvenientes comunes en el uso clínico de DOX son la cardiotoxicidad y la depresión de la médula ósea en dosis más altas7. DOX induce la apoptosis en células cancerosas mediante daño al ADN, generación de especies reactivas de oxígeno, detención del ciclo celular y activación de p538,9,10,11,12. Varios estudios han demostrado que la expresión de p53 de tipo salvaje es esencial para la respuesta citotóxica a los agentes quimioterapéuticos. Como guardián del genoma, el supresor de tumores p53 se activa tras el tratamiento con DOX y funciona como un factor de transcripción, regulando así genes diana posteriores como BAX, PUMA y MDM213,14,15. En este contexto, se ha descubierto que un par de regímenes combinados novedosos son más adecuados para el tratamiento de cánceres sin inducir efectos secundarios en los tejidos normales16,17. Se han realizado intentos para identificar agentes quimiosensibilizantes que podrían mejorar la eficacia de DOX y reducir así las dosis de DOX. Se estudiaron varios agentes como la curcumina, IFN-α, quercetina, selenocistina y ocotillol para potenciar la actividad antitumoral de DOX mediante la activación de p5318,19,20,21,22.

Las técnicas de administración de fármacos específicas para células cancerosas han recibido considerable atención en los últimos años. En este estudio, hemos utilizado ciclodextrina (CD), que se produce a partir del almidón mediante una reacción enzimática. Entre todos los tipos de ciclodextrina, la metil β-ciclodextrina (MCD), un heptasacárido cíclico que consta de cavidades exteriores hidrófilas e interiores hidrófobas23,24. El MCD es más accesible y se utiliza ampliamente en las industrias farmacéuticas, así como en investigaciones biológicas, porque aumenta la solubilidad, la administración y la biodisponibilidad de muchas moléculas, incluidos los fármacos. Es el agente más eficaz para la eliminación del colesterol de la membrana plasmática debido a su alta afinidad hacia él25. Anteriormente hemos informado que la MCD mejora la eficacia terapéutica del 5-fluorouracilo, el carboplatino y el tamoxifeno26,27. Además, otros estudios también informaron que el MCD o sus formas modificadas pueden aumentar el efecto citotóxico de diversos fármacos28,29. En este estudio, examinamos la capacidad de MCD para mejorar la eficacia terapéutica de DOX en células de cáncer de mama y de hígado tanto mediante estudios in vitro como in vivo. Nuestros resultados demuestran que la combinación de MCD y DOX reduce la proliferación celular al promover la apoptosis. Mecánicamente, MCD actúa como un quimiosensibilizador potencial al mejorar la muerte celular inducida por DOX mediante la activación de p53 y la inducción de la vía FasR/FasL.

Para investigar si MCD tiene algún efecto adverso sobre las células MCF-7 y Hepa1-6, se realizaron experimentos de detección para determinar la concentración no tóxica y el momento óptimo de MCD adecuado para su uso en tratamiento combinado. El tratamiento de células con diversas concentraciones de MCD (2,5 mM a 10 mM) durante 4 h inhibió la supervivencia celular de una manera dependiente de la dosis, medida mediante el ensayo MTT (Fig. 1A, D). MCD en dosis de 10 mM fue altamente tóxico para las células en comparación con 2,5 y 5 mM, por lo que se utilizó una concentración de 5 mM para experimentos adicionales. Además, se calculó que la dosis marginal de DOX para uso en el régimen combinado en células tratadas con DOX era 2,5 μM para ambas células (datos no mostrados). Dado que DOX se utiliza para el tratamiento de mama y CHC, es necesario definir un enfoque para mejorar el índice terapéutico de DOX en dosis más bajas. Investigamos los efectos combinados de MCD sobre el efecto inducido por DOX en células MCF-7 y Hepa1–6. Las células fueron tratadas con MCD junto con una dosis IC50 de DOX durante 24 h. Como se anticipó, con una dosis IC50 de DOX, la viabilidad celular se redujo en un 50%, que se redujo aún más a menos del 5% en presencia de MCD y estos resultados también se verificaron mediante un ensayo clonogénico a largo plazo (Fig. 1B, E, C). F). A continuación, exploramos los efectos de una dosis baja (1 μM) de DOX junto con MCD (5 mM) sobre la viabilidad de las células MCF-7 y Hepa1-6 y observamos una reducción significativa en la supervivencia celular en comparación con MCD y DOX solos (Fig. .1B,E). También se observaron resultados similares en ensayos clonogénicos a largo plazo (Fig. 1C, F). El aumento en el efecto inducido por DOX potenciado por MCD se debió a la inducción de apoptosis en células MCF-7 y Hepa1-6, como lo demuestra la representación gráfica de los datos FACS y el gráfico de barras representa el% de células positivas para anexina (Fig. 1G, H). De acuerdo con los resultados anteriores, el tratamiento combinado también provocó la escisión de PARP, una disminución en el nivel de proteína de la proteína antiapoptótica Bcl-2 y una regulación positiva de la proteína proapoptótica Bax (Fig. 1I). Las caspasas juegan un papel importante en las vías apoptóticas tanto intrínsecas como extrínsecas. Por lo tanto, al examinar los niveles de proteína de las caspasas en MCF-7 y Hepa1–6, encontramos que MCD junto con DOX activa la caspasa-8 y la caspasa-7 (Fig. 1J). Todos los resultados anteriores demuestran que MCD potencia la citotoxicidad inducida por DOX solo en células cancerosas (MCF-7 y Hepa1–6), no en las células de hepatocitos normales (AML12) (Figura complementaria 2A-D).

MCD potencia el efecto de DOX e induce la apoptosis en células cancerosas de mama y de hígado.

(A) Las células MCF-7 y (D) Hepa1–6 se trataron con las concentraciones indicadas de MCD (2,5–10 mM) durante 4 h y la viabilidad celular se midió mediante el ensayo MTT. (B) Las células MCF-7 y (E) Hepa1–6 se trataron con las concentraciones indicadas de DOX junto con MCD durante 24 h y se sometieron a un ensayo MTT. (C) Las células MCF-7 y (F) Hepa1–6 se trataron con las concentraciones indicadas de DOX junto con MCD durante 24 h y las células se sometieron a un ensayo clonogénico a largo plazo. (G) Las células MCF-7 y Hepa1–6 se trataron con la concentración indicada de DOX junto con MCD durante 24 h y las células apoptóticas se analizaron mediante tinción con anexina V-FITC mediante citometría de flujo. (H) Cuantificación de células positivas para anexina V-FITC. (I) Las células MCF-7 y Hepa1–6 se trataron con la concentración indicada de DOX junto con MCD durante 24 h. Se recogieron las células, los lisados de células completas se sometieron a inmunotransferencia y se evaluaron los niveles de proteínas de PARP, Bax y Bcl-2. Hsp60 sirvió como control de carga. (J) Las células MCF-7 y Hepa1–6 se trataron con la concentración indicada de DOX junto con MCD durante 24 h. Se recogieron las células, los lisados de células enteras se sometieron a inmunotransferencia y se evaluaron los niveles de proteína de caspasa-8 y caspasa-7 y su forma escindida. Hsp60 sirvió como control de carga. Las transferencias recortadas se utilizan en la figura principal y las transferencias completas se incluyen en la figura complementaria 1. Todo el gráfico de barras representa la media ± DE de un experimento realizado por triplicado (*P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001).

Para explorar el posible mecanismo de citotoxicidad inducida por DOX potenciada por MCD, examinamos el efecto de MCD sobre la captación intracelular de DOX mediante citometría de flujo. La cantidad de DOX en la célula es directamente proporcional a su fluorescencia porque DOX es un fármaco autofluorescente. La medición de la intensidad de fluorescencia de DOX se ha utilizado para evaluar la captación celular en las células30. Aunque las células como tales absorben DOX, curiosamente, después del tratamiento con MCD, la absorción celular de DOX mejoró significativamente, como lo demuestra la representación gráfica de los datos FACS y el gráfico de barras representa la fluorescencia roja media (Fig. 2A, B). La mejora en la acumulación de DOX por MCD se confirmó aún más mediante un microscopio de fluorescencia (Fig. 2C, D). MCD no potenció la captación de DOX en células AML12 (Figura complementaria 2E-F).

MCD aumenta la captación intracelular de DOX en células MCF-7 y Hepa1-6.

Las células MCF-7 y Hepa1–6 se trataron con la concentración indicada de DOX junto con MCD. (A) Histograma de citometría de flujo representativo de la captación intracelular de DOX en células MCF-7 y Hepa1–6. (B) El gráfico de barras es representativo de la cuantificación relativa de la absorción de DOX en células MCF-7 y Hepa1–6. (C) Las células MCF-7 y (D) Hepa1–6 se sometieron a microscopía confocal de inmunofluorescencia para la detección de la captación intracelular de DOX.

La p53 inducida por el estrés promueve la muerte celular y es un mecanismo molecular clave de los agentes antitumorales, como el DOX31. Exploramos el papel de p53 en la potenciación de la muerte celular inducida por DOX mediante MCD en células MCF-7 y Hepa1–6 mediante análisis de transferencia Western. Se detectó un nivel de proteína p53 relativamente menor en las células tratadas con MCD y DOX solos, mientras que el tratamiento combinado de MCD y DOX aumentó significativamente el nivel de proteína p53 y disminuyó el nivel de proteína MDM2, una proteína involucrada en la degradación de p53 (Fig. 3A). Además, el aumento de la expresión de p53 y su localización en el núcleo de las células se confirmaron mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia (Fig. 3B, C). La activación de p53 tras el daño del ADN conduce a una regulación positiva de varias proteínas. Entre estos, se ha demostrado que la proteína receptora de la muerte, FasR, está regulada positivamente en varias células cancerosas después del estrés genotóxico32,33,34. Además, p53 también aumenta el nivel de FasR en la membrana plasmática al promover el tráfico de FasR desde el Golgi35. El estado de FasR se determinó mediante citometría de flujo y análisis de transferencia Western y observamos que DOX y MCD juntos aumentaron significativamente la expresión de FasR en comparación con cualquiera de los agentes solos en células MCF-7 y Hepa1–6 (Fig. 3D, E). Además, también verificamos el nivel de proteína FasL en los lisados celulares y su forma secretada en el medio de cultivo recolectado de las células mediante transferencia Western y ELISA indirecto, respectivamente. La expresión de FasL en lisados de células completas, así como en el medio de cultivo, aumentó después del tratamiento de DOX y MCD juntos (Fig. 3E, F).

MCD potencia la muerte inducida por DOX de las células MCF-7 y Hepa1-6 de una manera dependiente de p53 mediante la regulación positiva de FasR/FasL.

Las células MCF-7 y Hepa1–6 se trataron con la concentración indicada de DOX junto con MCD durante 24 h. (A) Los niveles de proteína de p53 y MDM2 se examinaron mediante análisis de transferencia Western. Hsp60 sirvió como control interno y se utilizó un control de carga. (B) Las células MCF-7 y (C) Hepa1–6 se procesaron para inmunotinción para detectar la expresión de p53 y su localización nuclear mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia. (D) La tinción de la membrana FasR se realizó mediante citometría de flujo. (E) Los niveles de proteína de FasR y FasL se examinaron mediante análisis de transferencia Western y se utilizó Hsp60 como control de carga. (F) ELISA sándwich para la cuantificación de FasL secretada a partir de medio de cultivo de células MCF-7 y Hepa1–6. El gráfico de barras representa la media ± DE de un experimento realizado por triplicado. Las transferencias recortadas se utilizan en la figura principal y las transferencias completas se incluyen en la figura complementaria 3.

Investigamos si p53 está directamente involucrado en el aumento de la muerte celular inducida por DOX por MCD. El tratamiento de células MCF-7 y Hepa1–6 con inhibidor de p53, pifitrina-α (PFT-α) a 20 μM durante 24 h no mostró una citotoxicidad significativa según lo evaluado mediante el ensayo MTT (Fig. 4A, D). Cuando las células se trataron previamente con MCD seguido de PFT-α y el tratamiento posterior con DOX, la viabilidad celular aumentó significativamente, mientras que MCD junto con DOX promovió la muerte celular según lo evaluado mediante el ensayo MTT (Fig. 4B, E). Mediante un ensayo clonogénico a largo plazo, se observó un mayor número de colonias supervivientes en células tratadas con MCD, PFT-α y DOX en comparación con MCD más DOX (Fig. 4C, F). Además, PFT-α no jugó ningún papel en la absorción celular de DOX, como se muestra en la representación gráfica de los datos FACS y el gráfico de barras representa la fluorescencia roja media (Fig. 4G, H). Además, los niveles de proteína p53 disminuyeron significativamente y la proteína MDM2 aumentó después del tratamiento conjunto de MCD y DOX en presencia de PFT-α en comparación con el tratamiento con MCD y DOX. (Fig. 4I y J; panel p53 y MDM2, resaltado por un bloque rectangular). Como FasR/FasL son moléculas aguas abajo de p53, sus niveles también se redujeron significativamente en las células tratadas con MCD, DOX y PFT-α (Fig. 4I, J; panel de FasR y FasL, resaltado por un bloque rectangular). Para determinar la especificidad de p53, en la regulación de FASR/FasL, se transfectaron células MCF-7 con ARNip de p53 específico. Como se muestra en la Fig. 5K, en las células transfectadas con ARNip de p53, los niveles de proteína p53 y Fas/FasL se redujeron significativamente mientras que los niveles de MDM2 aumentaron en comparación con las células transfectadas con ARNip de control (Fig. 5K; paneles de p53 y MDM2, resaltados). por bloque rectangular).

El silenciamiento de p53 reduce la muerte celular inducida por DOX sensibilizada por MCD y la regulación negativa de FasR/FasL.

(A) Las células MCF-7 y (D) Hepa1–6 se trataron con concentraciones variables de PFTα (10–80 μM) durante 24 h y la supervivencia celular se evaluó mediante un ensayo MTT. (B) Las células MCF-7 y (E) Hepa1–6 se trataron con la concentración indicada de MCD, PFT-α y DOX durante 24 h. La viabilidad de las células se midió mediante ensayo MTT. (C) Las células MCF-7 y (F) Hepa1–6 se trataron con MCD, PFT-α y DOX como se indica y se realizó un ensayo clonogénico a largo plazo utilizando cristal violeta. (G) Histograma de citometría de flujo representativo de la captación intracelular de DOX en células MCF-7 y Hepa1–6 tratadas con MCD, PFT-α y DOX. (H) El gráfico de barras es representativo de la cuantificación relativa de la absorción de DOX en células MCF-7 y Hepa1–6. (I) Las células MCF-7 y (J) Hepa1–6 se trataron con la concentración indicada de MCD, PFT-α y DOX durante 24 h, los niveles de proteína de p53, MDM2, FasR y FasL se examinaron mediante análisis de transferencia Western. Hsp60 sirvió como control de carga. (K) Las células MCF-7 se transfectaron con ARNip de p53 según las instrucciones del fabricante. Después de 18 h de transfección, las células se expusieron con MCD y DOX juntos durante 24 h y se prepararon lisados de células completas y se sometieron a inmunotransferencia para p53, MDM2, FasR y FasL. Hsp60 sirvió como control de carga. Los gráficos de barras representan (media ± DE) experimentos realizados por triplicado. Las transferencias recortadas se utilizan en la figura principal y las transferencias completas se incluyen en la figura complementaria 5.

La combinación de MCD y DOX inhibe el crecimiento de tumores con isoinjertos Hepa1-6 en ratones C57BL/6J.

Se desarrollaron tumores derivados de células Hepa1-6 en ratones C57BL/6J. A los ratones portadores de tumores se les administró solución salina normal, 64 mg/kg de MCD (ip/día alternativo), 1 mg/kg de DOX (ip cada día alternativo) y una combinación de MCD y DOX. (A) Inicio y progresión del tumor (B) Cambios en el peso corporal (C) Mediana de supervivencia general de los ratones (D) Paneles representativos de tinción con H&E de los principales órganos vitales, como el corazón, el hígado, los riñones y los pulmones de los ratones (aumento 10x). (E) Análisis de transferencia Western de las proteínas indicadas (p53, MDM2, FasR, FasL, Bcl-2, Bax y Hsp60) de lisados tumorales de ratones a los que se les administró MCD, DOX y una combinación de ambos. (F) Se examinó el análisis inmunohistoquímico representativo de CD31, Ki67 y apoptosis en secciones de tumores mediante tinción con TUNEL. Los núcleos celulares se tiñeron de azul con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (aumento 60x). El ensayo TUNEL muestra núcleo apoptótico inducido (verde) en tumores de ratones a los que se les administró MCD y DOX juntos. (G) Gráfico de barras (media ± DE) que muestra la cuantificación del número promedio de células positivas CD31, Ki67 y TUNEL seleccionadas de diferentes campos mediante el software Image J. Las transferencias recortadas se utilizan en la figura principal y las transferencias completas se incluyen en la figura complementaria 6.

Para evaluar el efecto combinado de MCD y DOX sobre el crecimiento tumoral, se isoinjertaron ratones C57BL/6J con células Hepa1–6 en el flanco derecho. Cuando los tumores en todos los ratones alcanzaron un volumen promedio de aproximadamente 70 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos. A los ratones portadores de tumores se les administró MCD (64 mg/kg, cada días alternos, por vía intraperitoneal), DOX (1 mg/kg, cada día alternativo 4 h antes de la inyección de MCD, por vía intraperitoneal), o una combinación de ambos durante 18 días (total 9 tratamientos). La administración de MCD y DOX por sí solas no inhibió el crecimiento del tumor y el patrón de crecimiento del tumor fue similar. Sin embargo, el tumor progresó lentamente en ratones a los que se les administró MCD junto con DOX y el volumen del tumor se redujo en aproximadamente un 50% en comparación con los tumores en ratones a los que se les administró cualquiera de los agentes solos (Fig. 5A). No se observaron signos de toxicidad visibles en ratones a los que se les administró MCD, DOX o una combinación de ambos, según lo determinado mediante el control del peso corporal durante el transcurso del experimento (Fig. 5B). Curiosamente, en los ratones a los que se les administró MCD junto con DOX, no solo se redujo el volumen del tumor sino que también se mejoró la capacidad de supervivencia de los ratones de este grupo en comparación con los ratones de otros grupos (Fig. 5C). Además, mediante la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) no se observaron anomalías histopatológicas evidentes en órganos vitales como el corazón, el hígado, los riñones y los pulmones. (Figura 5D). También realizamos análisis de transferencia Western en los lisados de tumores. Se observó que los niveles de p53, FasR, FasL y Bax aumentaron mientras que se detectó una disminución en los niveles de MDM2 y Bcl-2, siendo el patrón idéntico a los resultados obtenidos mediante experimentos in vitro, como se muestra en la Fig. 5E. Además, se detectó una disminución en la expresión de CD31 (marcador endotelial) y Ki67 (marcador de proliferación) mediante inmunohistoquímica (IHC) en las secciones tumorales de ratones a los que se les administró MCD y DOX juntos en comparación con cualquiera de los agentes solos (Fig. 5F; Ki67 y CD31). panel). Finalmente, para obtener información sobre si este tratamiento combinado promueve eficazmente la apoptosis en los tumores, se sometieron secciones de tumores a un ensayo de marcado del extremo de la desoxinucleotidil transferasa dUTP terminal (TUNEL). El mayor número de células TUNEL positivas se observó claramente en ratones a los que se administró MCD junto con DOX en comparación con cualquiera de los agentes solos (Fig. 5F, panel TUNEL). El análisis cuantitativo de la tinción inmunohistoquímica de CD31, Ki67 y las de células TUNEL positivas se muestra en la Fig. 5G.

A pesar de los grandes avances en el tratamiento de los cánceres de mama y de hígado, la tasa de curación de estos cánceres está lejos del nivel deseado. Entre una variedad de fármacos quimioterapéuticos, DOX es un agente generalizado que se utiliza para tratar pacientes con cáncer de mama y de hígado. El efecto tóxico del DOX es motivo de preocupación que limita su utilidad. Por lo tanto, las modalidades para lograr la eficacia deseada y prevenir la toxicidad de dosis altas serían beneficiosas para este régimen terapéutico.

La membrana celular es el punto de entrada clave para los fármacos y contiene un microdominio de tamaño nanométrico enriquecido en colesterol, fosfolípidos y esfingolípidos. El colesterol, un socio esencial de las balsas de lípidos, proporciona estabilidad estructural a la membrana celular. Se ha descrito un aumento del metabolismo del colesterol y su acumulación en diversas células de cáncer de mama, próstata y boca36,37,38. Entre una variedad de agentes que reducen el colesterol, se encuentra la metil-β-ciclodextrina (MCD), el compuesto más eficaz utilizado para reducir el colesterol de la membrana plasmática de las células39. El MCD ha despertado un interés considerable en el área de investigación debido a su efecto sensibilizante sobre diversos fármacos quimioterapéuticos. El agotamiento del colesterol de la membrana distorsiona la integridad de las balsas lipídicas y aumenta la absorción de iones y pequeños no electrolitos.

En el presente estudio, utilizamos MCD como herramienta para mejorar la eficacia terapéutica de DOX y nuestros datos sugieren que el tratamiento con DOX y MCD juntos potencia de manera eficiente la muerte de las células MCF-7 y Hepa1-6. MCD agota el colesterol de las células (Figura 4A-B complementaria) y, por lo tanto, facilita la muerte celular inducida por DOX como consecuencia del aumento de los niveles de DOX intracelular. Por lo tanto, MCD aumenta la muerte celular inducida por DOX al aumentar la biodisponibilidad fisiológica de DOX en el núcleo de las células y mejora su índice terapéutico.

DOX es un potente fármaco que daña el ADN e induce la apoptosis en células cancerosas a través de dos vías distintas: la vía del receptor de muerte asociado a la membrana mediante la activación de la caspasa-8 y la vía mitocondrial mediante la activación de la caspasa-940. La vía asociada a la membrana es el mecanismo molecular clave de la muerte celular inducida por DOX que promueve la interacción de FasL con FasR, formando así un complejo de señalización inductor de muerte (DISC), que conduce a la activación en cascada de diferentes caspasas como caspasa-8, caspasa-3 y caspasa. -741. Además de las vías apoptóticas clásicas inducidas por DOX en células cancerosas, también puede inducir apoptosis mediante un nuevo tipo de muerte celular mitótica denominada fragmentación cromosómica que tiene lugar durante la metafase del ciclo celular y ocurre en células estresadas. Esto es distinto de la apoptosis típica, independiente de las caspasas y no demuestra ninguna escisión internucleosomal típica del ADN que no sea inhibida por la sobreexpresión de Bcl-242. En nuestro estudio, cuando las células MCF-7 y Hepa1–6 se trataron con una combinación de MCD y DOX, se detectó muerte apoptótica y las células parecían estar bajo estrés. Además de la apoptosis clásica en estas células, no se puede descartar la posibilidad de muerte celular mitótica. Descubrimos que el tratamiento de células con MCD y DOX juntos mejora la secreción de FasL en el medio de cultivo y la expresión de FasR en la membrana, lo que indica la interacción entre los dos. Un aumento significativo en la escisión de caspasa-8, que conduce a un aumento de la actividad de caspasa-7 y, en última instancia, a la degradación de PARP, sugiere que MCD aumenta la apoptosis inducida por DOX en células MCF-7 y Hepa1-6 a través de la vía extrínseca.

El estudio de Haupt, S. et al., ha demostrado que la proteína supresora de tumores p53 activa la vía apoptótica extrínseca mediante la inducción de genes que codifican diferentes proteínas de membrana como Fas, DR5 y PERP43. p53 funciona como factor de transcripción nuclear y regula la expresión de proteínas del ciclo celular, bloquea la progresión de la división celular o induce la apoptosis en respuesta a daños graves en el ADN44. Se ha informado que el p53 de tipo salvaje sensibiliza las células del carcinoma colorrectal al 5-fluorouracilo y al topotecán45. En el presente estudio, el tratamiento de células con DOX y MCD juntos induce un estrés severo que causa una mejora en el nivel de proteína p53 junto con un aumento en su localización nuclear, promoviendo así la apoptosis en las células MCF-7 y Hepa1-6. Estos resultados sugieren que p53 es un factor crucial para la muerte celular inducida por DOX y MCD juntos. Varias otras proteínas, como FasR y Bax, reguladas por p53 en respuesta a fármacos quimioterapéuticos, también participan en la muerte celular. Numerosos estudios han sugerido que la activación de p53 regula positivamente FasR ya que su promotor contiene un elemento sensible a p53 y la expresión disminuida de p53 se ha relacionado con una reducción en la muerte celular mediada por FasR46,47,48,49. Estudio de Lorenzo, E. et al. ha sugerido que el tratamiento de células endoteliales primarias humanas mediante DOX mejora la expresión de p53, que regula transcripcionalmente la expresión de FasR50. Nuestros resultados in vitro sugirieron que DOX junto con MCD aumentaron la acumulación nuclear de p53 y aumentaron la expresión de FasR en la superficie celular en células MCF-7 y Hepa1-6. Por el contrario, el silenciamiento de p53 por PFT-α o por ARNip redujo la expresión de FasR y evitó la muerte celular, lo que sugiere que FasR es el objetivo principal de p53. Nuestros datos in vivo demuestran que el tratamiento de DOX junto con MCD retarda significativamente el crecimiento del tumor en comparación con cualquiera de los agentes solos. La cuantificación de DOX en tejido tumoral y hepático no logró detectar DOX, excepto por la presencia de una intensidad muy débil de la firma de iones en el tejido renal de ratones administrados por MCD junto con DOX. Es probable que el nivel de DOX esté por debajo del umbral de detección (~1 ng/ml) o que la DOX se elimine rápidamente del tumor y del órgano vital (Figura 7 complementaria). Los ratones a los que se les administró MCD junto con DOX no mostraron ninguna toxicidad en los principales órganos vitales y la supervivencia de estos ratones fue mayor en comparación con otros grupos. La reducción en la progresión del tumor se debe principalmente al aumento de la expresión de la proteína de membrana FasR regulada por p53 en estos ratones.

En conclusión, el presente hallazgo demuestra que el MCD mejora eficientemente los efectos tóxicos del DOX mediante el agotamiento del colesterol de la membrana en las células MCF-7 y Hepa1-6. La función proapoptótica de DOX junto con MCD se debe a la activación de la vía apoptótica extrínseca por p53, lo que resulta en la escisión de las caspasas y finalmente conduce a la apoptosis. En conjunto, estos resultados sugieren que la combinación de una dosis baja de DOX y una dosis subóptima de MCD puede servir como una estrategia potencial para minimizar los efectos secundarios y mejorar la eficacia terapéutica de DOX en células de mama y CHC.

La metil β-ciclodextrina (MCD), la doxorrubicina (DOX), el inhibidor de p53 pifitrina-α (PFT-α) y el metiltioazol-tetrazolio (MTT) y el calibrador a vernier digital se adquirieron de Sigma-Aldrich (Sigma Aldrich, MO, EE. UU.). MCD y DOX se disolvieron en agua para preparar una solución madre 100 mM y 1 mM respectivamente y se diluyeron adicionalmente en medio de cultivo inmediatamente antes de su uso. Se preparó una reserva de PFT-α en DMSO. Los anticuerpos contra p53, MDM2, FasR, FasL, Bax, Bcl-2, PARP, Caspase-8, Caspase-7 y Hsp60, el medio de montaje que contiene DAPI se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE. UU.). Los portaobjetos de cámara recubiertos con colágeno se adquirieron en MP Biomedicals, CA, EE. UU.

Las células MCF-7 (cáncer de mama humano), Hepa1–6 (cáncer de hígado murino) y AML12 (hepatocitos normales) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA, EE. UU. y se mantuvieron en el repositorio celular interno del Centro Nacional. de Ciencia Celular (NCCS), Pune, India. Las células se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con FBS al 10 % inactivado por calor (Hyclone, UT, EE. UU.), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 μg/ml) (Invitrogen Life Technologies, CA, EE. UU.) y se incubaron a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO2 (Thermo Scientific, NC, EE. UU.).

Las células se trataron previamente con MCD durante 4 h. Posteriormente, las células se lavaron con medio fresco seguido de tratamiento con medio que contenía DOX durante 24 h. En todos los experimentos con PFT-α, las células se trataron previamente con MCD durante 4 h. Posteriormente, las células se lavaron y se añadió medio fresco que contenía PFT-α (20 μM) durante 1 h antes de la adición de DOX y se expuso continuamente al inhibidor durante 24 h de tratamiento.

Las células (5000/pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se dejaron crecer durante 24 h a 37 °C. Al día siguiente, las células se trataron con concentraciones variables de DOX durante 24 h con o sin MCD o PFT-α como se ilustra en la estrategia de tratamiento. La viabilidad de las células se midió mediante el ensayo MTT como se describe51.

Las células (5000/pocillo) se sembraron en placas de 12 pocillos y se dejaron crecer durante 24 h y se trataron según el plan experimental. Después de 24 h de tratamiento, el medio que contenía el fármaco se cambió por medio nuevo y se dejó que las células crecieran durante 8 a 10 días. Una vez finalizado el experimento, las células supervivientes se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 3%. Las células supervivientes se tiñeron con cristal violeta al 0,05% y se capturaron imágenes de las células con una cámara (Olympus, Tokio, Japón).

Las células (0,3 x 106) se sembraron en placas de cultivo de 35 mm y se trataron como se describió anteriormente. Después de 24 h de tratamiento, se recogió el medio y se detectó la FasL secretada en el medio mediante ELISA tipo sándwich como se describe52.

Las células (0,3 x 106) se sembraron en placas de cultivo de 35 mm y se trataron con MCD y DOX como se describió anteriormente. Las células se lisaron en PBS que contenía Triton X-100 al 2% durante 10 minutos. Después de la centrifugación (12.000 rpm, 15 min), el sobrenadante resultante se utilizó para estimar el colesterol como se describe27.

Las células (0,3 x 106) se sembraron en placas de cultivo de 35 mm y se dejaron adherir durante 24 h. Al día siguiente, las células se trataron como se describió anteriormente, seguido de la recolección de células mediante tripsinización y se procesaron adicionalmente para el análisis FACS para la tinción de la superficie FasR usando FACS Calibur (BD Biosciences, CA, EE. UU.). Brevemente, después de la tripsinización, las células se lavaron tres veces con PBS. Estas células se incubaron con anticuerpo primario contra FasR durante 1 h, se lavaron tres veces con PBS y luego se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con FITC durante 30 minutos en la oscuridad. Los análisis de citometría de flujo se realizaron con el citómetro de flujo FACS Calibur y los datos se analizaron con el software CellQuest Pro (BD Biosciences, CA, EE. UU.).

Las células (0,3 x 106) se sembraron en placas de cultivo de 35 mm y se dejaron adherir durante 24 h. Al día siguiente, las células se trataron como se describió anteriormente, seguido de la recolección de células mediante tripsinización y se procesaron adicionalmente para el análisis FACS utilizando FACS Calibur (BD Biosciences, CA, EE. UU.). Brevemente, las células se trataron con DOX durante 24 h con o sin MCD o PFT-α como se describe en la estrategia de tratamiento. Después de 24 h, las células se recogieron y se lavaron dos veces con PBS frío (pH = 7,4) y se incubaron con Anexina V-FITC en el tampón de unión (HEPES/NaOH 10 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 140 mM y CaCl2 2,5 mM) durante 10 min en la oscuridad a 37 °C. FACS Calibur clasificó las células en 10000 eventos para determinar las poblaciones de células vivas y muertas. Los datos se analizaron utilizando el software CellQuest Pro (BD Biosciences, CA, EE. UU.).

Las células (5000/pocillo) se sembraron en portaobjetos de cámara recubiertos con colágeno y se dejaron adherir durante 24 h a 37 °C. Al día siguiente, las células se trataron con MCD y DOX como se describió anteriormente. Una vez finalizado el experimento, las células se lavaron con PBS y se fijaron con metanol enfriado durante 5 minutos. Las células se tiñeron con medio de montaje que contenía DAPI. Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser (LSM510, Carl Zeiss, Alemania) para visualizar la acumulación intracelular de DOX y se capturaron fotografías. La fluorescencia de DOX se excitó con un láser de argón a 488 nm y la emisión se recogió a través de un filtro de 550 nm de largo. La absorción de DOX en las células se evaluó mediante citometría de flujo. En resumen, las células se cultivaron en placas de cultivo de 35 mm y se trataron con MCD, DOX o PFT-α durante 24 h. Después de 24 h, las células se recogieron mediante tripsinización y la suspensión de células se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos y se resuspendió en PBS. Se analizó un mínimo de 50.000 eventos de cada muestra para generar histogramas para la intensidad de fluorescencia. Los análisis de citometría de flujo se realizaron con el citómetro de flujo FACS Calibur y los datos se analizaron con el software CellQuest Pro (BD Biosciences, CA, EE. UU.).

Las células (5000/pocillo) se sembraron en portaobjetos de cámara recubiertos con colágeno y se dejaron adherir durante 24 h a 37 oC. Al día siguiente, las células se trataron con MCD y DOX como se describe anteriormente. Después de completar el experimento, las células se lavaron con PBS y se fijaron con metanol frío durante 5 minutos y luego se bloquearon con BSA al 3% y se procesaron para análisis de inmunofluorescencia como se describió anteriormente53. Se agregaron anticuerpos primarios contra p53 (1:50) y se incubaron durante la noche en una cámara húmeda. A continuación, las células se lavaron 3 veces con PBS. Se agregaron anticuerpos secundarios conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1:100) y se incubaron durante 1 h en una cámara húmeda. Después de lavar con PBS, se añadió medio de montaje que contenía DAPI y las células se analizaron mediante un microscopio confocal y se fotografiaron con un aumento de 60x.

Para la transferencia Western después de los tratamientos indicados como se describió anteriormente, las células se lavaron tres veces con PBS enfriado y se prepararon lisados de células completas y la inmunotransferencia se realizó como se describió anteriormente51.

Se sembraron células MCF-7 (0,3 x 106) en placas de cultivo de 35 mm y se transfectaron con ARNip de p53 humano específico como lo describen Chhipa et al.53. Las células se cultivaron adicionalmente durante 24 h seguido del tratamiento con MCD y DOX como se describió anteriormente. Se prepararon lisados de células completas para inmunotransferencia como se describió anteriormente51.

La DOX se extrajo del tumor, el hígado y el riñón de ratones inyectados con MCD junto con DOX según el método descrito54. DOX se cuantificó en muestras biológicas utilizando Agilent 6340 Iontrap (ESI LC-MS, Agilent Technologies, Alemania). Todos los datos se adquirieron en modo de ionización positiva con un espectrómetro de masas operado en Monitoreo de Reacción Múltiple (MRM) en un modo de alta resolución como se describe27.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales, siguiendo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Ética Animal (IAEC) de NCCS, Pune, India. Se resuspendieron células Hepa 1–6 (5 × 106) en 100 μl de PBS estéril y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de un macho C57BL/6J de cuatro a cinco semanas de edad (peso 20 ± 2 g) adquirido en una instalación de animales experimentales (EAF) de NCCS. . Cuando los tumores se volvieron palpables, los ratones portadores de tumores se dividieron arbitrariamente en cuatro grupos, cada uno de los cuales contenía seis animales (n = 6). Grupo (a), ratones a los que se les administró control de vehículo, grupo (b), ratones a los que se les administró MCD (64 mg/kg, por vía intraperitoneal), grupo (c), ratones a los que se les administró DOX (1 mg/kg, por vía intraperitoneal) y grupo (d), ratones coadministrados con MCD y DOX. MCD y DOX se disolvieron en agua esterilizada, se diluyeron aún más con PBS y luego se administraron a ratones. Los tamaños de los tumores se midieron cada día alternativo utilizando un calibrador Vernier digital. El volumen del tumor (mm3) se calculó según la fórmula A × B2 × 0,52 (A = largo; B = ancho; todos los parámetros en milímetros). Una vez finalizado el experimento, los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical y se extirparon los tumores para la preparación de lisados y la inmunotransferencia. Para estudios inmunohistoquímicos (IHC) e histopatológicos, se fijaron secciones de tumores y órganos en paraformaldehído al 10% inmediatamente después de la escisión.

Se prepararon secciones finas (4–5 μm) a partir de tumores y órganos fijados con formalina e incluidos en parafina y se fijaron en portaobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina (Safeline Histopathology, Centre, Pune, India). Los estudios inmunohistoquímicos (IHC) e histopatológicos se realizaron como se describió anteriormente26.

El ensayo dUTP Nick End Labeling (TUNEL) mediado por TdT para secciones de tumores se realizó utilizando APO-DIRECT (BD Biosciences, CA, EE. UU.) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las secciones de tumores se trataron con proteinasa K (10 mg/ml) durante 30 min. A continuación, las secciones del tumor se lavaron tres veces con PBS y se tiñeron con la mezcla de reacción TUNEL durante la noche en una caja fría y se lavaron tres veces con PBS. Los portaobjetos se montaron con medio de montaje que contenía DAPI. Los portaobjetos se visualizaron mediante microscopía confocal y las células TUNEL positivas se cuantificaron mediante el software Image J.

La comparación estadística se realizó mediante la prueba t no pareada de dos colas de Student utilizando el software Sigma Plot (Systat Software Inc., CA, EE. UU.). Los valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. La cuantificación de las colonias se realizó utilizando el software NIH Image J (Image J Freeware; http://rsb.info.nih.gov/ij/).

Cómo citar este artículo: Mohammad, N. et al. Estrategia para mejorar la eficacia de la doxorrubicina en células tumorales sólidas mediante la metil-β-ciclodextrina: participación del complejo ligando del receptor p53 y Fas. Ciencia. Rep. 5, 11853; doi: 10.1038/srep11853 (2015).

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Los autores agradecen al Dr. SC Mande, Director, NCCS, Pune, India y al Dr. GC Mishra, exdirector, NCCS, Pune, India, por su gran apoyo y estímulo para llevar a cabo este trabajo. NM y BC agradecen al Consejo de Investigaciones Científicas e Industriales (CSIR) de la India; SVS y PM agradecen a la Comisión de Becas Universitarias (UGC), Nueva Delhi, India; DA agradece al Departamento de Biotecnología (DBT) de la India por la beca de investigación. También se reconoce debidamente el apoyo del Centro Experimental de Animales (EAF), el Centro Instrumental Central y el personal técnico del NCCS. Los autores también agradecen al Centro de Investigación Analítica Amrita Agilent, la Escuela de Biotecnología Amrita, la Universidad Amrita Vishwa Vidyapeetham, Kollam, India, por los datos espectrométricos de masas y a la Sra. Revathy MR por ayudar en la recopilación de datos de EM. Apoyos financieros: este trabajo fue apoyado por una subvención interna del NCCS financiada por el Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India. Nota: Este trabajo se realizó como parte del cumplimiento del Ph.D. Tesis de NM que se presentará a la Universidad Savitribai Phule Pune, Pune, India. Este trabajo se presentó parcialmente en la quinta conferencia internacional de la Carcinogenesis Foundation (EE. UU.), Mumbai, del 11 al 13 de febrero de 2015.

Centro Nacional de Ciencia Celular, Campus de la Universidad de Pune, Ganeshkhind, 411007, Pune, India

Naoshad Mohammad, Shivendra Vikram Singh, Parmanand Malvi, Balkrishna Chaube, Dipti Athavale y Manoj Kumar Bhat

Escuela Amrita de Biotecnología, Universidad Amrita Vishwa Vidyapeetham, Kollam, 690525, India

Muralidharan Vanuopadath, Sudarslal Sadasivan Nair y Bipin Nair

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Concibió y diseñó los experimentos: MKB y NM Realizó los experimentos: NM, SVS, PM, BC y DA Realizó los experimentos de espectrometría de masas: MV, SSN y BN Analizó los datos: NM y MKB Escribió el artículo: NM y MKB Todos los autores revisados el manuscrito.

Los autores no declaran tener intereses financieros en competencia.

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Mohammad, N., Vikram Singh, S., Malvi, P. et al. Estrategia para mejorar la eficacia de la doxorrubicina en células tumorales sólidas mediante la metil-β-ciclodextrina: participación del complejo ligando del receptor p53 y Fas. Representante científico 5, 11853 (2015). https://doi.org/10.1038/srep11853

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Recibido: 30 de marzo de 2015

Aceptado: 20 de mayo de 2015

Publicado: 07 de julio de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep11853

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